1、目的
　　通過采用基因重組的技術表達的谷丙轉氨酶蛋白和谷草轉氨酶蛋白研制人谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶混合標準品,用于臨床檢驗實驗室以及谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶試劑盒的質量控制。通過以正常人的血清為原料研制人巨細胞病毒IgG抗體參考品,用于臨床檢驗實驗室和人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒的質量控制。
　　方法
　　一、重組人轉氨酶標準物質的研制
　　1、目的基因的獲得。從NCBI網(wǎng)站上查詢人谷丙轉氨酶蛋白和人谷草轉氨酶蛋

2、白的序列,根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子表,對查找的序列進行優(yōu)化,并將優(yōu)化成功的基因序列送生物公司合成。
　　2、表達菌株構建。通過雙酶切的方法將合成的基因從復制型載體上切下,連接入表達載體PRSF-Duet,構建出表達載體PRSF-ALT和PRSF-AST,并轉化至大腸桿菌BL21中,構建出基因工程菌株。
　　3、蛋白的表達、純化及活性測定。用IPTG誘導蛋白的表達,對蛋白誘導表達過程中所需的IPTG濃度和誘導溫度進行探索,并對表

3、達的蛋白通過親和層析和分子篩層析的方法進行純化,獲得人谷丙轉氨酶蛋白和人谷草轉氨酶蛋白,并對獲得的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶蛋白進行活性測定。
　　4、基質血清的處理。對收集的正常人血清進行血源篩查后,對合格血清進行去纖維化處理以制備轉氨酶的基質。
　　5、標準品的制備。將制備的谷丙轉氨酶蛋白和谷草轉氨酶蛋白按一定濃度加入基質血清中,混勻,并分裝至1.5mL的凍存管中完成標準品的制備。
　　6、標準品的稀釋。同時用3份轉氨

4、濃度不同的血清和生理鹽水對標準品進行稀釋,將稀釋后的樣品進行測定。統(tǒng)計分析測定結果。
　　7、標準品的評價。對制備的標準品進行均勻性和穩(wěn)定性的評價。
　　8、標準物質的定值以及不確定度的評估。將研制的待測標準物質通過三家轉氨酶參考實驗室,用IFCC參考方法對轉氨酶標準品進行定值。對研制的轉氨酶標準品的不確定度進行評估。
　　二、人巨細胞病毒IgG抗體參考品的研制
　　9、參考品原料的獲得。將收集的血漿進行去纖維化

5、處理并進行血源篩查試驗,用人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒對收集的血清進行篩選,篩選出10份人巨細胞病毒IgG抗體陽性血清和5份人巨細胞病毒IgG抗體陰性血清。
　　10、參考品原料的確認和復核。用間接免疫熒光和Westernblot的方法對參考品原料進行確認,用國內外的試劑盒對參考品原料進行復核。
　　11、參考品的驗證。用國內外六家公司生產(chǎn)的試劑盒對制備的參考品從準確性、特異性以及靈敏度三個方面進行評價。
　　12

6、、參考品穩(wěn)定性的考察。用人巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒對參考品在不同條件下的穩(wěn)定性進行考察。
　　結果
　　通過對人谷丙轉氨酶基因和人谷草轉氨酶基因序列進行優(yōu)化,并將轉氨酶基因克隆至PRSF-Duet載體中,將載體轉化至大腸桿菌BL21菌體中,成功表達了人谷丙轉氨酶蛋白和谷草轉氨酶蛋白,通過蛋白的純化得到了活性為80000U/L的谷丙轉氨酶蛋白和活性為136000U/L的谷草轉氨酶蛋白,將轉氨酶蛋白制成轉氨酶標準品,通過對

7、轉氨酶標準品進行評價,得出轉氨酶標準品均勻性良好、穩(wěn)定性良好。最后對標準品進行定值和不確定度評估,得出谷丙轉氨酶活性為1020.5U/L,不確定度為194.40U/L。谷草轉氨酶活性為792.9U/L,不確定度為78.37U/L。
　　用試劑盒篩選出人巨細胞病毒IgG抗體的陽性血10份,陰性血5份,用兩家不同的試劑盒對篩選的血清進行復核,結果符合預期,用免疫印跡和免疫熒光實驗對篩選的血清進行確認,結果符合要求。將確認正確的血清制成