1、該文旨在為通過體細胞克隆途徑生產轉基因綿羊和山羊建立一套實用的核移植技術程序.為此采用成纖維細胞作為供體細胞對體細胞核移植各個關鍵步驟包括:卵母細胞成熟、去核、融合和激活的條件進行摸索.此外,對供體細胞周期同步化的方法和利用同源重組打靶栽體生產轉基因羊的技術進行了初步探索.選擇綿羊和山羊的成年和胎兒成纖維細胞建系并進行Sry PCR性別鑒定.培養(yǎng)后期添加早期培養(yǎng)細胞的條件培養(yǎng)液,有利于保持體外培養(yǎng)至20代的細胞染色體數正確,不發(fā)生顯著變

2、化,因此20代內細胞可以用于基因轉染、篩選以及核移植.綿羊卵母細胞成熟時間和去核時間以24小時為宜;成纖維細胞與卵母細胞適宜電融合條件為:5V交流電預處理,脈沖場強2.0v/cm,脈沖時程20-30μsec,脈沖次數兩次;重構胚采用離子霉素激活的卵裂率顯著高于乙醇和A23187處理組.山羊卵母細胞成熟率在成熟培養(yǎng)20-28小時內變化不顯著;去核時間24-26小時為宜;成纖維細胞與卵母細胞的融合場強范圍適宜在2.0-2.6kv/cm;離子

3、霉素+1.9mM6-DMAP處理組原核形成率顯著高于離子霉素+10μg/ml CHX處理組以及添加2μg/ml CD的CHX激活組.山羊卵母細胞成熟28小時激活,胚胎的桑椹胚和囊胚形成率最高.該文還對體細胞克隆生產定點整合轉基因胚胎進行了初步研究.實驗中采用pLoxp正負篩選載體構建的mAAT同源重組載體(mAAT)和Myostatin同源敲除型載體(Myo),以及基于pEGFP載體構建的GFP同源重組型載體,轉染山羊和綿羊的成年和胎兒

4、成纖維細胞,經G418和GANC篩選的陽性細胞作為供體進行核移植.隨機型GFP和同源型GFP供體細胞其融合率、卵裂率和發(fā)育至桑椹和囊胚的百分率在不同細胞系有顯著差異;GFP、Myo和mAAT體細胞重構胚的融合率和卵裂率無顯著差異(P>0.05);綿羊mAAT組桑囊率顯著低于GFP和Myo組;山羊GFP與Myo細胞之間的核移植效率差異不顯著.早期克隆胚胎能夠表達外源基因,說明在體細胞中整合同源重組型表達載體實現基因在胚胎中定點整合是可行的