1、喹賽多是喹噁啉類化合物飼料添加劑，兼有抑菌及促生長功效，且安全低毒、用藥后迅速吸收及消除、殘留期短、無蓄積，在畜牧生產中具有良好的應用潛力。本實驗室通過連續(xù)親和層析實驗和生物質譜技術初步篩選出喹賽多在人正常肝細胞HL-7702（L-02）內的特異結合蛋白為核內不均一核糖核蛋白A2/B1（hnRNP A2/B1），并且用分子對接軟件預測出它們之間的結合位點為Lys(101)、Arg(102)和Ala(105)。但是喹賽多與hnRNP A2

2、/B1的具體相互作用及它們結合后引起的生物學效應并沒有得到確證和研究，而喹賽多與靶蛋白之間作用位點、親和力的研究對于弄清楚其藥理機制具有重要的意義。本課題將通過體外重組表達hnRNP A2/B1蛋白及其突變蛋白，進行表面等離子體共振實驗(SPR)，研究喹賽多與hnRNP A2/B1之間的結合特性，并通過RNA干擾實驗（RNAi）研究hnRNP A2/B1對喹賽多調節(jié)細胞內增殖相關基因表達的影響，分析喹賽多促生長的作用機理。
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3、.喹賽多與hnRNP A2/B1的相互作用
　　針對分子對接中預測的喹賽多與hnRNP A2/B1的3個結合位點，Lys(101)、Arg(102)和Ala(105)，根據(jù)氨基酸定點突變原則分別將其突變?yōu)锳la(101)、Ala(102)和Gly(105)。構建原核表達質粒pET28a-hnRNP A2/B1、Lys101Ala、Arg102Ala、Ala105Gly，通過大腸桿菌體外大量表達目的蛋白，利用His-tag親和Ni柱

4、純化目的蛋白并用Western blot技術驗證后，與喹賽多進行SPR實驗。通過多循環(huán)方法檢測到喹賽多與hnRNP A2/B1及突變蛋白R(R101A)和A(A102G)都能結合，具有濃度依賴性。同時喹賽多與野生型hnRNP A2/B1的親和力要強于突變蛋白，因此Arg(102)對其結合有一定的影響，而對Lys(101)進行突變后蛋白與喹賽多完全失去相互作用，說明Lys(101)直接參與了喹賽多與hnRNP A2/B1的結合，是一個關鍵

5、的結合位點。
　　2.喹賽多作用L-02細胞產生的生物學效應
　　通過RNAi實驗抑制L-02細胞內的hnRNP A2/B1后，用實時熒光定量qRT-PCR檢測喹賽多作用前后hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21 mRNA的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)將L-02細胞內hnRNP A2/B1干擾后5種基因的mRNA表達水平均有顯著性下調，說明在L-02細胞內這4種基因與hnRNPA2/B1關系密切。同時，使

6、用2μM喹賽多孵育L-02細胞1h后，空白加藥組與干擾加藥組之間各基因表達相比均有顯著性差異，說明hnRNP A2/B1對喹賽多調節(jié)下游基因有重要的作用。結合SPR實驗結果喹賽多在體外能直接與hnRNP A2/B1結合，推測喹賽多在L-02細胞內也很有可能通過與hnRNPA2/B1結合產生效應。
　　用2μM喹賽多孵育L-02細胞1h后，通過qRT-PCR檢測到hnRNP A2/B1、mki-67、c-myc、ccnd2、p21的

7、mRNA水平均有顯著性的上調，可以推測喹賽多作用于L-02細胞后，與細胞生長和增殖密切相關的mki-67和c-myc的mRNA水平隨著hnRNPA2/B1的上調而上調，隨著時間的延長，與細胞周期及凋亡相關的ccnd2及p21等基因出現(xiàn)了負反饋調節(jié)，控制細胞生長的速度。
　　綜上所述，本課題通過SPR和RNAi實驗研究了喹賽多與hnRNP A2/B1的相互作用和喹賽多作用細胞后引起的生物學效應，發(fā)現(xiàn)hnRNP A2/B1在體外能與喹

8、賽多直接結合，且Lys(101)是其相互作用中的關鍵結合位點，Arg(102)則對hnRNPA2/B1與喹賽多的結合有一定的影響。喹賽多作用于L-02細胞后，與細胞生長和增殖密切相關的mki-67和c-myc的mRNA水平隨著hnRNP A2/B1的上調而上調，可能使細胞增殖加快。同時為了保持細胞內的動態(tài)平衡，避免出現(xiàn)異常的過度增殖，與細胞周期及細胞凋亡相關的ccnd2及p21基因出現(xiàn)了負反饋調節(jié)，減緩細胞增殖的速度。因此，喹賽多作用于