1、c-myc是惡性腫瘤中失常頻率最高的癌基因之一,許多惡性腫瘤的發(fā)生、演變與c-myc的異常高表達有關.在人急性早幼粒白血病HL-60細胞中c-myc異常高表達是惡性腫瘤細胞維持生長的重要原因,與臨床急性早幼粒白血病的發(fā)展及預后關系密切.c-myc基因表達異?？梢宰钄囿w外造血細胞進行分化的過程,實驗證實阻斷細胞分化功能的位點與c-myc蛋白惡性轉化的作用位點幾乎是一樣的.細胞體外進行分化時,c-myc基因表達明顯下降,高表達的c-myc基

2、因則干擾細胞分化過程.反義核酸技術為抑制c-myc的高表達提供一種良好的途徑.它比基因敲除(gene knockout)、基因替換(gene replacement)等方法更簡單易行,有利于臨床應用.通過腺病毒載體構建重組病毒,具有靶細胞廣泛;對增殖、靜止期細胞都可轉染;不會產生突變;外源基因裝載量大等諸多優(yōu)點.已經進入臨床實驗治療.白血病細胞表面缺少腺病毒纖毛蛋白受體,限制了其轉導效率.近年通過對腺病毒表面纖毛蛋白的改造及輔助轉導技術

3、的使用,這一問題得到不斷改進.使腺病毒載體在腫瘤的基因治療的范圍得到擴大.目的:通過多聚陽離子輔助重組Lac-Z腺病毒載體(Ad-LacZ)轉染急性早幼粒HL-60細胞,嘗試提高重組腺病毒載體對HL-60細胞的轉染效率.利用重組反義c-myc腺病毒載體(Ad-Asc-myc)轉染HL-60細胞誘導其分化,研究其分化過程的分子機制.探討反義c-myc腺病毒載體用于急性白血病基因治療中的可能性.方法:將多聚陽離子與Ad-LacZ混合轉染HL

4、-60細胞,通過X-gal染色觀察LacZ基因表達,得出轉染效率.Ad-Asc-myc與多聚陽離子混合轉染HL-60細胞,利用RT-PCR及免疫細胞化學染色觀察其對轉染細胞c-myc轉錄及蛋白表達水平的影響.MTT、臺盼藍排斥試驗檢測Ad-Asc-myc對轉染細胞的生長及活力的影響,Wright's染色觀察細胞形態(tài)的變化.NBT、非特異酯酶染色了解細胞的分化功能變化,流式細胞儀檢測轉染細胞的細胞周期分布、細胞分化抗原CD<,13>及CD

5、<,33>的變化,免疫細胞化學染色觀察分化、增殖相關基因PCNA、hTERT和c-fos的表達.結果:MOI:100, Ad-LacZ組轉染效率:35.9﹪,Ad-LacZ+protamine sulfate:79.8﹪Ad-LacZ+polybrene:40.7﹪,多聚陽離子輔助可提高腺病毒對HL-60細胞的轉染, protamine sulfate優(yōu)于polybrene.Ad-Asc-myc降低了c-myc基因在轉錄及蛋白水平的表達

6、.可以抑制HL-60細胞生長及活力.在細胞形態(tài)、白細胞分化抗原及功能上出現粒系分化特征.細胞周期分析:Ad-Asc-myc轉染組出現G<,0>/G<,1>阻滯,S期細胞下降.分化增殖相關基因PCNA、hTERT表達降低,c-fos基因表達增強.結論:Ad-Asc-myc在多聚陽離子輔助下能有效轉染人急性早幼粒白血病HL-60細胞.轉染后能降低HL-60細胞c-myc的表達.抑制HL-60細胞的生長,使細胞阻滯于G<,0>/G<,1>期,