1、目的:樹突狀細胞(DCs)是動物體內功能最強的抗原呈遞細胞(antigenprocessing cell,APC)。在捕獲腫瘤細胞之后,DC遷移到淋巴結中將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細胞,誘導其成為具有腫瘤特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL),后者能特異性殺傷腫瘤細胞。本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠的脾T淋巴細胞,經(jīng)負載神經(jīng)膠質瘤抗原的DC激活后,使之成為具有抗腫瘤特異性的CTL,未負載腫瘤抗原的則為非特異

2、性CTL,將特異性CTL和非特異性CTL作為對比實驗,輸入移植性小鼠神經(jīng)膠質瘤模型中,通過測量腫瘤體積以及HE染色等實驗技術,研究腫瘤特異性CTL在小鼠體內對神經(jīng)膠質瘤細胞的生長抑制以及殺傷作用。
　　方法:在小鼠骨髓中分離得到細胞懸液,以rhGM-CSF、rhIL-4、和TNF-α進行誘導培養(yǎng),定期觀察細胞形態(tài)的變化,收集其中的部分細胞做流式細胞術(flow cytometry,FCM)分析,確定其為可以使用的DC細胞。用神經(jīng)膠

3、質瘤細胞凍融抗原刺激DC,使之成為DC疫苗。制備小鼠脾T細胞,進行體外培養(yǎng),并和DC疫苗共培養(yǎng),從而誘導產(chǎn)生具有腫瘤抗原特異性的CTL,未經(jīng)負載腫瘤抗原的DC誘導的CTL就是非特異性CTL。將特異性CTL和非特異性CTL分別與神經(jīng)膠質瘤細胞共培養(yǎng),研究其對神經(jīng)膠質瘤細胞的體外殺傷作用。同時,小鼠皮下注射腫瘤細胞懸液,建成小鼠移植瘤模型,兩周后將小鼠隨機分成三組,每組6只,每5天尾靜脈注射一次:①空白對照組(每只小鼠只局部注射生理鹽水0.

4、2 mL)。②特異性CTL組(每只小鼠局部注射抗原特異性CTL5×106個/mL0.2 mL)。③非特異性CTL組(每只小鼠局部注射非特異性CTL5×106個/mL0.2mL)。每隔5天用游標卡尺測量腫瘤長徑(a)、短徑(b),根據(jù)體積(V)=πab2/6計算腫瘤的體積,并計算腫瘤抑制率,分析腫瘤的生長抑制情況。30天后處死小鼠取出瘤塊組織。將腫瘤放入福爾馬林溶液中進行固定、脫水、石蠟包埋切片,然后進行病理學經(jīng)典的HE染色,并在鏡下觀察

5、對照組和CTL治療組腫瘤細胞形念的變化。彗星實驗檢測腫瘤細胞的凋亡。
　　結果:1.從DC誘導第2天起,可在倒置顯微鏡下觀察到部分細胞體積有所增大,形態(tài)由圓形開始變得不規(guī)則,成多形性,可見細刺狀胞漿突起。誘導之前,DC的特異性表面標志物CD80、CD86的百分比分別為1.25±0.09和1.74±0.11,經(jīng)與rhGM-CSF、rhIL-4共同培養(yǎng),并經(jīng)rmTNF-α誘導后,標志物水平明顯升高,分別為99.02±5.34和99.4

6、7±6.28,P＜0.01;2.小鼠骨髓來源的T淋巴結細胞在體外誘導培養(yǎng)前,CD3+、CD4+、CD8+細胞所占百分比分別為63.84±3.21、26.32±2.42和30.29±3.42。經(jīng)負載腫瘤抗原的DC誘導T淋巴細胞后,在細胞因子rmIL-2的刺激培養(yǎng)下,特異性CTL組細胞的CD3+、CD4+、CD8+細胞百分比分別為72.37±2.54、27.59±1.91和68.35±2.74:經(jīng)未負載腫瘤抗原的DC誘導T淋巴細胞后,非特異

7、性CTL組細胞的CD3+、CD4+、CD8+細胞百分比分別為70.28±2.34、25.29±1.14和63.59±3.24。與DC誘導之前相比,誘導之后的T淋巴細胞中,CD3+和CD8+T細胞的含量均有明顯的升高(P＜0.01),而CD4+T細胞含量升高并不顯著(P＞0.05):3.神經(jīng)膠質瘤移植性小鼠模型成活率100％;4.各治療組對腫瘤生長都有抑制作用,從第15天開始到第30天,對照組與各治療組移植瘤體積都具有顯著性差異。特異性C

8、TL組對移植瘤生長抑制最明顯,治療15天后腫瘤體積平均達70±2.94 mm3,小于非特異性CTL組(93±2.43 mm3),與空白對照組(122±5.25 mm3)相比,差異具有顯著性(P=0.000),特異性CTL組抑瘤率(72.85±4.38)％明顯高于非特異性CTL組(47.14±2.96)％抑瘤率,差異有顯著性(P＜0.05);5.移植瘤標本進行HE染色,鏡下證實移植瘤為神經(jīng)膠質瘤,治療組瘤組織可見有大量淋巴細胞浸潤;6.彗