1、許多養(yǎng)殖魚(yú)類生長(zhǎng)具有明顯的性別二態(tài)性，性控育種技術(shù)是水產(chǎn)養(yǎng)殖增加產(chǎn)量和提高效率的有效途徑。尼羅羅非魚(yú)雄魚(yú)比雌魚(yú)生長(zhǎng)快，全雄養(yǎng)殖還可避免過(guò)度繁殖，因此，單性化養(yǎng)殖是羅非魚(yú)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。尼羅羅非魚(yú)是一種世界性的養(yǎng)殖魚(yú)類，性別受到單基因決定，具有XX/XY性別決定系統(tǒng)，人們提出遺傳全雄羅非魚(yú)（genetic male tilapia，GMT）技術(shù)控制性別，即采用YY超雄羅非魚(yú)與正常XX個(gè)體交配繁殖全雄XY魚(yú)，但是至今這個(gè)技術(shù)還沒(méi)有在水產(chǎn)養(yǎng)殖中推廣

2、，難點(diǎn)在于YY維持系的建立，YY雌魚(yú)誘導(dǎo)難度大，需要更高的雌激素處理濃度和更長(zhǎng)的處理時(shí)間，即便獲得YY雌魚(yú)其育性也很低，本實(shí)驗(yàn)室獲得的YY雌魚(yú)甚至不育，目前亟須圍繞這個(gè)問(wèn)題開(kāi)展羅非魚(yú)性別決定與分化的分子機(jī)制研究，為最終實(shí)現(xiàn)其遺傳性別控制的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)方法。gsdf是魚(yú)類特有的TGF-?家族成員基因，在魚(yú)類精巢高表達(dá)，最近在青鳉中的研究表明它在精巢分化中具有重要作用。Wt1在哺乳類參與雄性別決定與分化，而在魚(yú)類中的功能不是很清楚

3、。而魚(yú)類由于魚(yú)類特有的基因組的復(fù)制（3R）具有2個(gè)亞型：wt1a和wt1b。本研究通過(guò)CRISPR/Cas9建立了羅非魚(yú)gsdf和wt1敲除系，并對(duì)敲除系進(jìn)行分析，研究gsdf和wt1在性別分化和性腺發(fā)育中的作用，并在ZX奧尼雜交雄性羅非魚(yú)（尼羅羅非魚(yú)XX♀×奧利亞羅非魚(yú)ZZ♂）中敲除gsdf研究其在魚(yú)類性別分化中功能是否保守，主要研究結(jié)果如下：
　　1、在本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)CRISPR/Cas9在尼羅羅非魚(yú)敲除gsdf獲得F0代陽(yáng)

4、性魚(yú)的基礎(chǔ)上，采用F0代陽(yáng)性魚(yú)開(kāi)展gsdf基因純合敲除建系，分析了F0代XY嵌合體敲除率與性腺表型的關(guān)系，以及gsdf敲除的F1代雜合子和F2代純合子的表型。發(fā)現(xiàn)敲除率≧58％的XY性腺在90 dah（days after hatching，孵化后天數(shù)）時(shí)發(fā)育為卵精巢，在180和240 dah時(shí)完全逆轉(zhuǎn)為卵巢，敲除率<58%的XY性腺發(fā)育為正常精巢，F(xiàn)1代XYgsdf+/-性腺都發(fā)育為精巢，而F2代XY gsdf-/-性腺都發(fā)育為卵巢。

5、通過(guò)F1代XY gsdf+/-與F0代性逆轉(zhuǎn)的XY雌魚(yú)回交，獲得了YY gsdf-/-，60dah時(shí)通過(guò)組織學(xué)觀察顯示它們都發(fā)育為卵巢。說(shuō)明gsdf是尼羅羅非魚(yú)雄性性別分化所必需的基因，且在雄性性別分化過(guò)程中Gsdf的需求有一定閾值。
　　2、免疫組化檢測(cè)純合突變性腺分化早期的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)：XY gsdf-/-性腺在10 dah雄性通路已經(jīng)開(kāi)啟，表達(dá)Dmrt1，然后在18 dah，雌雄通路都開(kāi)啟，同時(shí)表達(dá)Dmrt1和Cyp19a1

6、a，在孵化后36天，關(guān)閉了雄性通路，僅開(kāi)啟雌性通路，只表達(dá)Cyp19a1a，并出現(xiàn)I時(shí)相的卵母細(xì)胞，完成了由雄向雌的性逆轉(zhuǎn)，表明在沒(méi)有Gsdf的情況下，XY性腺可開(kāi)啟雄性信號(hào)通路，表達(dá)Dmrt1，但不能夠維持。通過(guò)對(duì)正常XY性腺鄰近切片免疫組化分析發(fā)現(xiàn)4 dah時(shí)Gsdf和Dmrt1均沒(méi)有表達(dá)，而在5 dah之后，Gsdf和Dmrt1共表達(dá)于性腺的支持細(xì)胞。對(duì)gsdf啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)上面具有一個(gè)Dmrt1的結(jié)合位點(diǎn)。在HEK293細(xì)胞

7、中進(jìn)行g(shù)sdf啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)Dmrt1單獨(dú)轉(zhuǎn)染不能激活gsdf的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)與Sf1共轉(zhuǎn)染時(shí)Dmrt1能夠劑量依賴地增強(qiáng)Sf1激活的gsdf轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明在尼羅羅非魚(yú)雄性性別決定通路中g(shù)sdf是dmrt1的下游靶基因。
　　3、通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)90dah gsdf-/-性腺基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)雌激素合成酶cyp19a1a表達(dá)的基因foxl2在XY gsdf-/-個(gè)體的表達(dá)水平顯著高于正常的XY gsdf+/+個(gè)體，

8、而與XX gsdf+/+和gsdf-/-個(gè)體差異不顯著，雄激素合成酶cyp11b2在 XY gsdf-/-個(gè)體的表達(dá)水平顯著低于正常的XY gsdf+/+個(gè)體，而與XX gsdf+/+和gsdf-/-個(gè)體差異不顯著，血清雌激素（E2，17β-estradiol）和雄激素（11-KT，11-ketotestosterone）水平檢測(cè)得到與此相一致的結(jié)果。通過(guò)芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor。AI）投喂處理XY gsd

9、f-/-個(gè)體，處理時(shí)間從10到35 dah，能夠回救敲除表型，性腺發(fā)育為精巢，表達(dá)Dmrt1和Cyp11b2，回救魚(yú)在180 dah能產(chǎn)生正常精子，并能夠正常授精。表明Gsdf可能通過(guò)下調(diào)雌激素的合成、上調(diào)雄激素的合成而促進(jìn)精巢的分化，但其涉及的分子機(jī)制有待闡明。
　　4、引入奧利亞羅非魚(yú)培育建立純系和雜交系。將ZZ奧利亞雄魚(yú)與尼羅羅非魚(yú)XX雌魚(yú)交配，獲得了100%的ZX雄性羅非魚(yú)。將ZX雄魚(yú)與尼羅羅非魚(yú)XX回交，獲得了1:1的雌

10、雄性比。將ZW奧利亞雌魚(yú)與YY超雄尼羅羅非魚(yú)雜交，獲得了100%雄性后代。奧利亞ZZ雄魚(yú)與ZW雌魚(yú)交配，獲得了1:1的雌雄比后代。采用Fadrozole處理能將奧利亞ZW雌魚(yú)逆轉(zhuǎn)為正常雄魚(yú)，ZW雄魚(yú)與尼羅XX雌魚(yú)雜交，獲得1:1的雌雄性比后代。將ZW雄魚(yú)與ZW雌交配，可以獲得3:1的雌雄性比。結(jié)合尼羅非魚(yú)XX為雌魚(yú)，XY為雄魚(yú)，以及奧利亞非魚(yú)ZZ為雄魚(yú)，ZW為雌魚(yú)的事實(shí)，說(shuō)明了在尼羅和奧利亞羅非魚(yú)性染色體的性別控制能力由強(qiáng)到弱為：Y>W

11、>Z>X。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得了奧利亞羅非魚(yú)的gsdf ORF序列，發(fā)現(xiàn)其與尼羅羅非魚(yú)序列相似度達(dá)到99.5%。通過(guò)免疫組化研究了Gsdf在ZX全雄雜交羅非魚(yú)性腺的10 dah表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ZX性腺與XY性腺一樣高表達(dá)Gsdf。進(jìn)一步在ZX魚(yú)CRISPR/Cas9敲除gsdf，近一半F0代陽(yáng)性魚(yú)性逆轉(zhuǎn)為雌魚(yú)，證明了gsdf在不同遺傳背景下保守的促進(jìn)雄性性別分化的功能。
　　5、通過(guò)原位雜交研究了wt1a和wt1b的表達(dá)。在腎臟中，w

12、t1a表達(dá)于3、5、20和40 dah腎小球中，而wt1b在3dah的腎小球中不表達(dá)，5、20和40 dah都表達(dá)于腎小球中。在早期性腺中，wt1a和wt1b都表達(dá)于3和5 dah的性腺體細(xì)胞中；在成魚(yú)卵巢中，wt1a表達(dá)于顆粒細(xì)胞、鞘膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，wt1b表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞；在成魚(yú)精巢中，wt1a表達(dá)于支持細(xì)胞，wt1b表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)CRISPR/Cas9敲除了wt1a和wt1b，并分別構(gòu)建了純合敲除系。wt1a-/-在6 da

13、h時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重腹水，10 dah全部死亡，wt1b-/-不致死。進(jìn)一步組織切片觀察發(fā)現(xiàn)6 dah時(shí)wt1a-/-個(gè)體的腎臟中未見(jiàn)腎小球形成，wt1b-/-和對(duì)照的腎小球發(fā)育正常。wt1a在腎小球早期單獨(dú)表達(dá)，可能對(duì)其發(fā)育至關(guān)重要，wt1b不能補(bǔ)償wt1a在腎臟早期發(fā)育中的功能。在180 dah對(duì)wt1b純合敲除的后代進(jìn)行分析：組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)XX wt1b-/-性腺發(fā)育為正常的卵巢，XY wt1b-/-性腺發(fā)育為正常的精巢；免疫組化分析顯示

14、wt1b-/-的XX性腺表達(dá)Cyp19a1a,不表達(dá)Cyp11b2，wt1b-/-的XY性腺,表達(dá)Cyp11b2，不表達(dá)Cyp191a；血清激素水平顯示，wt1b-/-的XX個(gè)體E2和11-KT與對(duì)照XX（wt1b+/+和wt1b+/-）雌魚(yú)差異不顯著；XY wt1b-/-個(gè)體E2和11-KT對(duì)照XY（wt1b+/+和wt1b+/-）雄魚(yú)差異不顯著。wt1b-/-的雄性個(gè)體在180 dah時(shí)能產(chǎn)生精子，并能夠正常授精。wt1a純合敲除致

15、死，其對(duì)性別決定的功能不得而知，而wt1b純合突變不會(huì)影響羅非魚(yú)存活和性別決定，wt1b在精巢發(fā)育中的功能冗余，在卵巢發(fā)育是否冗余需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　綜上所述，gsdf純合敲除能夠?qū)е耎Y和YY魚(yú)性別逆轉(zhuǎn)，證明是Gsdf在羅非魚(yú)雄性性別決定通路必需基因。也為建立羅非魚(yú)YY維持系提供了新的技術(shù)途徑。Dmrt1能在gsdf純合敲除后的XY性腺表達(dá)，gsdf啟動(dòng)子具有Dmrt1結(jié)合位點(diǎn)，且啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)Dmrt1在Sf1存在的情況下能

16、上調(diào)gsdf的轉(zhuǎn)錄，表明gsdf在羅非魚(yú)雄性性別通路中位于dmrt1的下游。gsdf可能是通過(guò)下調(diào)雌激素水平、上調(diào)雄激素水平來(lái)控制雄性性別的。與XY一樣，在ZX雜交魚(yú)中敲除gsdf同樣導(dǎo)致由雄向雌的性逆轉(zhuǎn)，證明Gsdf在具有不同遺傳背景的羅非魚(yú)雄性性別分化中功能保守。wt1a純合敲除致死說(shuō)明wt1a對(duì)于羅非魚(yú)存活至關(guān)重要，且wt1b不能補(bǔ)償wt1a的功能。wt1a純合敲除致死，其對(duì)性別決定的功能不得而知，wt1b純合敲除不會(huì)影響羅非魚(yú)的