1、研究背景和目的:
　　 前列腺癌是一種常見的男性泌尿系統腫瘤，并且在美國的男性腫瘤死亡率排名第二[1]。雖然局限性前列腺癌患者在成功地接受根治性前列腺切除術或者放射性治療后能夠獲得良好的治療效果，但是前列腺癌患者往往死于激素難治性腫瘤和腫瘤遠處轉移。在實際的臨床工作中，由于各種客觀原因以及缺乏特異性的診斷標準，使泌尿外科醫(yī)生對于辨別哪部分前列腺癌患者術后可能出現腫瘤進展、腫瘤復發(fā)，需要及時給予進一步的輔助治療這個問題上產生一定的

2、困難。前列腺癌患者的預后情況根據腫瘤的臨床分期和病理分級呈現多種的變化。許多科研人員希望尋找前列腺癌的特異性分子標記物來幫助臨床醫(yī)生解決臨床上所遇到的困境。研究發(fā)現許多敏感度高的新型前列腺癌分子標記物與腫瘤的生物學侵襲行為有關，并且能夠對疾病的診斷和治療產生重要的臨床價值?，F階段，如何有效地治療前列腺癌的轉移已經成為前列腺癌治療方法的一個重要難題[2]。最近，許多研究的焦點集中在如何利用各種預測前列腺癌預后情況的臨床指標來建立一個診斷模

3、型準確地提供必要的臨床信息[3-5]。前列腺癌腫瘤細胞根據其所屬種類具有高度或者低度的腫瘤轉移潛能，包括細胞分化、細胞間粘附、細胞侵襲力和細胞運動力。這些促進腫瘤進展的因素都是正常機體細胞向腫瘤細胞轉變過程中相應基因改變的結果。因此，尋找和發(fā)現一個能夠準確地預測前列腺癌進展、復發(fā)和轉移的新型分子標記物將會使我們進一步地了解前列腺癌的潛在機制，為前列腺癌患者提供更有效的靶向治療，達到更好的治療效果。細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑，又叫CD14

4、7，是一類相對分子質量為50000-60000屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily，IGSF)的跨膜糖蛋白。CD147分子在人體內分布非常廣泛，參與炎癥反應、精子發(fā)生、胚胎發(fā)育等各種不同的生理過程。不僅如此，CD147分子已經被廣泛證實在多種惡性腫瘤細胞表面高度表達[6]。研究發(fā)現CD147通過誘導細胞外基質金屬酶（MMPS）的合成參與腫瘤的轉移和增強腫瘤的侵襲力。腫瘤侵襲和轉移是多步驟的復雜過程，

5、包括基底膜降解、基質滲透以及腫瘤細胞進出血管和對靶組織的侵襲。其中腫瘤周圍基底膜的降解是腫瘤細胞向鄰近纖維結締組織浸潤進而向遠處轉移過程中最基本的一步。所有這些都要求由MMPS等蛋白水解酶來介導基底膜組成成分和細胞外基質大分子的重塑。除此以外，CD147增強腫瘤侵襲性的途徑包括激活ERK1/2和p38絲裂原活化蛋白酶通路促進腫瘤細胞的分化，通過PI3K-Akt信號旁路來調節(jié)血管生長因子(VEGF)的表達來促進腫瘤內血管生長，通過產生透明

6、質烷增強腫瘤細胞抵抗化療藥物的能力和通過抑制Bim加強腫瘤細胞抵抗堿性環(huán)境的能力[7-11]門。還有文獻報道，抑制CD147的表達可以激活半胱天冬酶-3，從而降低細胞的穩(wěn)定性和導致DNA斷裂[10]。另外，CD147的表達與乳腺癌、黑色素瘤、肝癌等腫瘤的臨床預后相關[2,13,14]。Zou W等使用RNA干擾技術抑制CD147的基因表達不但可以降低腫瘤的侵襲力和惡性程度，還可以增強腫瘤細胞對紫杉醇類化療藥物的敏感性[15]。雖然關于C

7、D147在腫瘤進展過程中的作用已經引起腫瘤學界的關注，但是關于CD147與良性前列腺增生、腫瘤轉移病變和不同前列腺癌分期的之間的聯系，特別是CD147的表達與無PSA生化復發(fā)生存率、無腫瘤遠處轉移生存率的關系仍然未有相關的報道。本次研究主要對240例確診為前列腺癌的石蠟組織標本進行CD147的免疫組化分析，每例前列腺癌標本都有明確的Gleason評分和詳細的臨床病理資料。我們利用統計學原理分析CD147表達與所有病例的無PSA生化復發(fā)生

8、存率，無腫瘤轉移生存率和總體生存率之間的關系，揭示CD147在腫瘤進展過程中所起的重要作用。研究目的在于說明CD147參與前列腺癌轉移、復發(fā)等不良預后過程和證明CD147是否能夠成為一個預測前列腺癌生化復發(fā)、轉移進展和預期壽命的獨立指標。另外，當正常的前列腺組織發(fā)生癌變時，細胞可能發(fā)生許多分子水平上的異常，如基因啟動子甲基化異常、促癌基因的高表達等，根據表觀遺傳調控在腫瘤發(fā)病中的理論研究基礎，我們也在本課題中對CD147的甲基化情況進行

9、初步的探討，驗證甲基化修飾水平是否能夠調控CD147在前列腺癌中的表達。
　　 材料:
　　 臨床病例
　　 從1993年至1995年期間，共240名前列腺癌患者在哈佛醫(yī)學院附屬麻省總醫(yī)院(MGH，Boston，MA)接受根治性前列腺切除術治療，術后前列腺癌組織制作成石蠟切片后納入本次研究中。凡是在術前或者術后曾經接受雄激素治療或者放射性治療的病例均被排除在實驗組外。所有實驗組前列腺癌組織標本均經過H-E染色并由

10、病理科醫(yī)生明確診斷。病理科醫(yī)生根據現行的前列腺癌病理分級評分標準(International Society of Urological Pathology)[16]對全部240例標本進行Gleason評分，每例標本中最高Gleason評分的前列腺癌部分均被用于制作前列腺癌組織芯片。每例標本均記錄以下相關臨床數據:年齡，術前PSA水平，Gleason評分，美國癌癥聯合委員會(American JointCommittee on Canc

11、er)病理腫瘤分期，手術切緣情況，PSA生化復發(fā)情況和時間，術后腫瘤轉移情況和時間和總體生存時間。無PSA生化復發(fā)生存時間指手術當天至首次發(fā)現連續(xù)兩次血清PSA水平升高之間的時間間隔;無腫瘤遠處轉移生存時間指手術當天至首次發(fā)現腫瘤轉移病灶之間的時間間隔;總體生存時間指手術當天至隨訪結束或者患者死亡之間的時間間隔。用于甲基化研究的臨床病例，由廣州市第一人民醫(yī)院提供。我們的研究經過麻省總醫(yī)院倫理委員會和中華人民共和國衛(wèi)生部批準。
　　

12、 組織芯片制作
　　 病理科醫(yī)生使用手動組織芯片制作工具(Beecher Instruments，SilverSpring，MD)進行前列腺癌組織芯片的制作。首先，240例前列腺癌標本制作成石蠟切片后進行H-E染色，病理醫(yī)生反復查看并確定每例標本的Gleason評分，在每例標本上標記GS最高的位點。然后根據標記，使用直徑0.6毫米的組織穿刺針從石蠟塊中抽取需要的樣本并按順序排列在玻片上。每塊玻片上都含有遠離癌旁的正常前列腺組織

13、作為對照。另外，還有20例正常前列腺組織用作免疫組化分析的陰性對照。最后，組織芯片經H-E染色后再次進行確認。
　　 方法:
　　 使用Real-time PCR和Western blot對各種良惡性前列腺細胞株進行CD147表達水平的檢測;以不同濃度(0，2.5，5，7.5，10uM)的甲基化抑制藥物5-Aza-2'-deoxycytidine處理P69和PC3細胞，驗證藥物處理后CD147表達水平的變化;使用甲基化特

14、異性檢測試劑盒，分別對細胞株及臨床石蠟樣本進行CD147啟動子甲基化分析;最后對CD147表達陽性的前列腺癌標本進行焦磷酸測序，從基因測序方面直接對甲基化定性定量。240例石蠟標本按照5微米的厚度進行切片，使用二甲苯溶液脫蠟，重新水化后的組織芯片留待H-E染色或者免疫組化。經過蛋白水解消化和過氧化酶封閉組織玻片等步驟后，加入濃度為1∶1000的一抗在4C環(huán)境中過夜孵育。經過洗滌和二抗孵育后，在顯微鏡下觀察CD147的染色情況。確認染色程

15、度滿意，使用蘇木紫溶液復染，封片。正常前列腺組織用作為陰性對照。每塊組織玻片分別由兩位經驗豐富的病理科醫(yī)生獨立觀察，所有關于臨床病理和治療效果的患者資料均對觀察者隱瞞。最后的觀察結果由兩位醫(yī)生進行比對后確定，任何存在分歧的部分均重新觀察和討論后得出一致的結果。CD147表達陽性結果定義為在10個代表性顯微鏡下區(qū)域發(fā)現細胞的表面或者細胞質中出現CD147表達。如果超過5％的腫瘤細胞出現CD147表達則定義為CD147陽性表達。
　　

16、 統計學分析:統計學分析分別由兩位統計學專家使用SAS9.2版本(SAS Institute，Cary，NC)獨立完成，兩組結果經過校對后確定最終結果。所有的連續(xù)變量均表示為X±s。所有四格表資料均使用Fisher精確檢驗，非四格表記數資料使用Pearson卡方檢驗。在單因素和多因素分析中，Cox比例危險模型用于計算CD147的表達與無PSA生化復發(fā)生存率、無腫瘤遠處轉移生存率和總體生存率之間的關系。Kaplan-Meier法主要用于

17、生存曲線分析并經過log-rank檢驗。CD147表達情況與各種臨床數據之間的關聯使用兩獨立樣本t檢驗和x2檢驗方法驗證。P＜0.05代表具有統計學意義。
　　 結果:
　　 CD147在前列腺癌患者腫瘤組織中的表達情況和位置
　　 我們使用中國第四軍醫(yī)大學生物研究中心提供的CD147抗體對前列腺癌組織芯片進行免疫組化實驗。CD147抗體主要聚集在前列腺癌細胞膜和細胞質中，染色的程度分為低、中、高程度。前列腺癌組

18、織的CD147陽性表達率為47.08％[113/240]，而前列腺組織的CD147陽性表達率為5％[1/20]，二者差別有統計學意義(P=0.006)。我們對CD147陽性表達情況和相，關的各項臨床病理數據進行統計學分析，發(fā)現CD147的表達與Gleason評分(P=0.0002)，手術切緣腫瘤陽性(P＜0.0001)，無PSA生化復發(fā)生存率下降(P＜0.0001)，無腫瘤轉移生存率下降(P＜0.0001)和總體生存率下降(P＜0.00

19、02)存在重要聯系。在Kaplan-Meier生存分析中，CD147的陽性表達能夠降低無PSA生化復發(fā)生存率、無腫瘤轉移生存率和總體生存率。
　　 CD147的表達情況與手術效果之間的關系
　　 單因素分析表明CD147的表達和Gleason評分都可以作為前列腺患者無PSA生化復發(fā)生存時間、無腫瘤轉移生存時間和總體生存時間的重要預測指標(P＜0.05)。分析也提示術前血清PSA水平(P＜0.001)，臨床病理分期(P=0

20、.0023)和手術切緣情況(P=0.0036)只能夠預測前列腺癌患者無PSA生化復發(fā)生存時間。多因素分析表明CD147的表達和Gleason評分均可以作為前列腺癌患者無PSA生化復發(fā)生存時間，無腫瘤轉移生存時間和總體生存時間的獨立預測指標(P＜0.05)。另外，術前血清PSA水平只可以獨立預測無PSA生化復發(fā)時間，而臨床病理分期和手術切緣情況均對預測前列腺癌預后情況無統計學意義。
　　 CD147的表達情況與Gleason評分、

21、臨床病理分期之間的關系
　　 Gleason評分是至今為止判斷前列腺癌患者預后情況的最可靠指標。本次研究中我們發(fā)現CD147的陽性表達率隨著G]eason評分的升高而上升。無論是單因素分析還是多因素分析都表明兩者是前列腺癌患者無PSA生化復發(fā)生存時間、無腫瘤轉移生存時間和總體生存時間的重要預測指標。Kaplan-Meier生存曲線顯示在Gleason≤6和Gleason=7分組中，CD147的陽性表達與無PSA生化復發(fā)生存時間的

22、降低有關，但是在
　　 Gleason≥8分組中這種關系無統計學意義。至于總體生存率方面，CD147的表達在Gleason≤6分組中存在統計學意義(p=0.0160)。另外，Kaplan-Meier生存曲線顯示CD147的表達在高分期(pT3)(p＜0.0001和p=0.0028)和低分期(pT2)(p＜0.0001和p=0.0253)的病例中都與無PSA生化復發(fā)生存時間和總體生存時間有關。
　　 CD147啟動子甲基化

23、情況
　　 P69細胞經過甲基化抑制藥物處理后，基因表達水平和蛋白表達水平隨著藥物濃度的增加呈現上升趨勢，而PC3細胞的CD147表達量并未發(fā)生明顯改變。P69和RWPE-1的甲基化檢測實驗呈現陽性結果，說明CD147啟動子檢測序列中存在5個以上的甲基化CpG位點，而PC3等前列腺癌細胞株均呈現陰性結果。同樣，前列腺增生的甲基化檢測呈現陽性結果，而CD147表達陽性的前列腺癌標本則呈現陰性結果。焦磷酸測序結果顯示3例前列腺癌標本

24、（CD147表達陽性）啟動子區(qū)域的6個CpG位點甲基化修飾程度低，百分比均未超過10％。
　　 結論:
　　 1.與正常的前列腺細胞相比，CD147在前列腺癌中的表達明顯增強。
　　 2.CD147的表達與Gleason評分，手術切緣情況，血清PSA生化復發(fā)，術后腫瘤轉移和腫瘤患者總體生存時間存在重要聯系。
　　 3.CD147表達陽性可能降低前列腺癌患者的無PSA生化復發(fā)生存率、無腫瘤轉移生存率和總體生

25、存率。
　　 4.CD147的表達情況可能作為除Gleason評分外的一個獨立判斷前列腺癌患者預后情況的預測指標。
　　 5.CD147的表達不僅可以預測pT2期前列腺癌患者的無PSA生化復發(fā)生存率和總體生存率，而且也可以應用于pT3期前列腺癌患者的預后判斷中。
　　 6.CD147的表達可以預測Gleason≤6的前列腺癌患者的無PSA生化復發(fā)生存率和總體生存率，但是不能應用于高Gleason評分的患者中。