1、軟骨是一種半透明并且有彈性的組織,它的結構和功能平衡至關重要。一旦這種平衡被打破,軟骨將會導致病變。關節(jié)軟骨由于缺乏血管供應、神經(jīng)支配、淋巴回流,損傷后難以進行修復。隨著工程學、材料科學和細胞生物學的迅猛發(fā)展,用組織工程學技術體外制造具有生物學特性和功能的軟骨組織成為解決這一難題最有希望的方法。骨髓間充質干細胞(Bone mesenthymal stem cells,BMSCs)由于來源方便,擴增快,目前被認為是軟骨組織工程最佳的種子細

2、胞。力學因素和生物化學因素在BMSCs向軟骨細胞分化的過程中起關鍵作用?；诖?本課題分兩部分來研究滾壓載荷生物反應器及不同狀態(tài)軟骨細胞對兔骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化的作用和不同狀態(tài)軟骨細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)下對骨髓間充質干細胞向軟骨細胞誘導分化作用。
　　 1 滾壓載荷生物反應器促進兔骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化的研究
　　 目的:觀察滾壓載荷生物反應器對BMSCs-瓊脂糖復合體中BMSCs向軟骨細胞誘導分化的作用。<

3、br>　　 方法:分離新西蘭兔BMSCs,培養(yǎng)至第三代后與低熔點瓊脂糖復合成凝膠塊并在自制的模具中形成直徑為4mm高為4mm的圓柱形膠塊。將樣本分為TGF-β1+力學組、TGF-β1組、力學組和對照組進行不同的處理。在第7、14、21天時去各組標本進行實時定量PCR、GAG含量檢測以及組織學染色。
　　 結果:TGF-β1+力學組Ⅱ型膠原基因表達在第7、14、21天三個時間點隨時間的推移逐漸增強,并在第21天時顯著增強。第7天

4、TGF-β1+力學組、TGF-β1組、力學組Ⅱ型膠原基因表達分別上調2.5±0.24(P＜0.05)、1.8±0.12和1.9±0.20倍,蛋白聚糖基因表達分別上調2.7±0.34(P＜0.05)、2.6±0.06和2.1±0.07倍。而對照組Ⅱ型膠原基因表達下調0.6±0.08倍,蛋白聚糖基因表達下調0.8±0.10倍。第14天TGF-β1+力學組、TGF-β1組、力學組、對照組Ⅱ型膠原基因表達分別上調5.7±0.61(P＜0.05)

5、、3.4±0.54(P＜0.05)、3.2±0.36和1.2±0.22倍,蛋白聚糖基因表達分別上調8.6±1.61(P＜0.05)、7.7±1.42(P＜0.05)、6.7±0.93和1.2±0.04倍。第21天TGF-β1+力學組、TGF-β1組、力學組、對照組Ⅱ型膠原基因表達分別上調7.1±1.21(P＜0.05)、4.9±0.89(P＜0.05)、5.6±0.92(P＜0.05)和1.4±0.08倍,蛋白聚糖基因表達分別上調14.

6、3±1.81(P＜0.05)、9.7±1.12(P＜0.05)、10.5±0.90和1.6±0.08倍。TGF-β1+力學組蛋白聚糖基因在第21天時也較對照組顯著增強并且高于其它兩組。對照組的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因在三個時間點均未見明顯增強。TGF-β1+力學組、TGF-β1組、力學組、對照組的第7天的GAG含量分別為2.10±0.33、1.69±0.12、1.58±0.16、0.13±0.05μg/(mg濕重),第14天的GAG含量分

7、別為3.56±0.32、2.33±0.25、2.64±0.085、0.20±0.04μg/(mg濕重),第21天的GAG含量分別為4.63±0.28、2.68±0.35、3.35±0.34、0.27±0.0118μg/(mg濕重)。TGF-β1+力學組GAG含量在三個時間點均明顯升高(P＜0.05)并且均高于其余三組。TGF-β1+力學組標本甲苯胺藍染色較其余各組明顯藍染,并有軟骨陷窩樣結構。
　　 結論:滾壓載荷生物反應器可以

8、有效促進BMSCs-瓊脂糖復合體中BMSCs向軟骨細胞誘導分化。在結合TGF-β1后這種促進作用更加明顯。
　　 2 不同狀態(tài)軟骨細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)下對骨髓間充質干細胞向軟骨細胞誘導分化作用的研究
　　 目的:觀察不同代次正常軟骨細胞和關節(jié)炎軟骨細胞對瓊脂糖-BMSCs的向軟骨細胞分化的促進作用。
　　 方法:分離新西蘭兔BMSCs,正常軟骨細胞。制作兔關節(jié)炎模型,提取兔關節(jié)炎軟骨細胞。將BMSCs和低熔點瓊脂糖復

9、合成凝膠塊,放在自制的六孔板網(wǎng)格架上,構建兔軟骨細胞-BMCSs共培養(yǎng)系統(tǒng)。在3、7、14天取各組瓊脂糖-BMSCs凝膠塊進行實時定量PCR、GAG含量檢測。
　　 結果:兔關節(jié)炎模型制作成功,關節(jié)面色澤較灰暗,關節(jié)軟骨粗糙。Normal P0-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的5.11±0.3、7.2±0.39、11.2±0.58倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.25±0.2、0.75±0.

10、35、1.05±0.48倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的2.1±0.22、3.8±0.41、22.5±0.39倍。Normal P3-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的0.71±0.3、1.5±0.57、1.8±0.38倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.92±0.13、1.2±0.33、1.8±0.30倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的0.7±0.22、1.0±0.28、1.58±0.40倍。OA

11、P0-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的1.0±0.37、1.73±0.74、3.6±0.36倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.98±0.22、0.65±0.14、1.21±0.22倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的0.95±0.15、6.2±0.68、7.8±0.44倍。OA P3-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的1.1±0.35、0.67±0.39、1.51±0.

12、22倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.4±0.12、0.6±0.4、0.8±0.13倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的1.28±0.28、0.95±0.39、1.12±0.41倍。Normal P0-BMSCs組的Ⅱ型膠原基因表達隨時間的增加明顯增強,Normal P3-BMSCs組Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達均未見明顯增強,OA P0-BMSCs組蛋白聚糖基因表達明顯增強,OAP3-BMSCs組Ⅰ型膠原基因表達水平在3個時間點均

13、低于對照組。NormalP0-BMSCS、Normal P3-BMSCS、OA P0-BMSCs、OA P3-BMSCs組的GAG含量分別為5.7±0.49、2.3±0.41、2.5±0.31、1.8±0.59μg/(mg濕重)。OAP0-BMSCs組GAG含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),其余三組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:兔正常PO軟骨細胞與兔關節(jié)炎PO軟骨細胞所分泌的形態(tài)