1、本研究借鑒綿羊多胎主效基因研究的成果，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，克隆山羊多胎性狀候選基因GDF9和BMP15，并檢測基因突變，分析其與濟寧青山羊多胎性能的關(guān)系，為濟寧青山羊高繁殖力的標(biāo)記輔助選擇和多胎山羊育種提供理論依據(jù)。 1、山羊GDF9基因全長的克隆與序列分析 以發(fā)表的綿羊GDF9序列為基礎(chǔ)，設(shè)計8對引物，采用PCR技術(shù)從山羊基因組中直接擴增GDF9基因片斷，克隆測序后連接成完整的山羊GDF9基因(GenBan

2、k：EF446168)。生物信息學(xué)分析表明，序列全長5508bp，由兩個外顯子組成，第一外顯子397bp，第二外顯子965bp，共編碼453個氨基酸，中間被1123bp的內(nèi)含子隔開。將山羊GDF9基因全長與綿羊和牛進行BLAST比對，DNA的同源性分別達到97％和94％，編碼序列同源性分別達到99％和96％，氨基酸序列同源性分別達到98.6％和95.58％。 2、應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)分析山羊GDF9基因外顯子SNPs

3、 根據(jù)山羊GDF9基因序列設(shè)計10對引物，采用PCR-SSCP技術(shù)檢測GDF9基因外顯子突變位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在山羊GDF9編碼序列第183bp、719bp、959bp、1189bp處分別發(fā)生了C→A、C→T、A→C、G→A的單堿基突變。序列分析顯示C183A突變沒有引起氨基酸的改變，C719T突變位點使蛋白質(zhì)第240位氨基酸殘基由由纈氨酸變?yōu)楸彼?，A959C突變位點使第320位氨基酸殘基由谷氨酰胺變?yōu)楦彼?，G1189A突變位點導(dǎo)致第3

4、97位氨基酸殘基由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼帷?3、應(yīng)用LDR技術(shù)分析山羊GDF9基因多態(tài)性及其對產(chǎn)羔數(shù)的影響 應(yīng)用LDR技術(shù)對濟寧青山羊(234只)、魯北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)進行GDF9四個突變位點的群體檢測，適合性X2檢驗結(jié)果表明除白山羊在A959C突變位點處于非Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)外，其它各個群體在四個位點的基因頻率均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。比較四個位點在三個品種中的基因

5、型頻率分布，濟寧青山羊與沂蒙黑山羊之間，四個位點均沒有顯著差異，而濟寧青山羊和魯北白山羊之間，四個位點均有極顯著差異(P＜0.01)，魯北白山羊和沂蒙黑山羊之間，在C183A、C719T和G1189A位點，均有極顯著差異(P＜0.01)，而在A959C位點，二者沒有顯著差異。 利用SAS軟件GLM過程對四個位點的的基因型效應(yīng)和產(chǎn)羔數(shù)進行了最小二乘分析，結(jié)果表明C183A突變對濟寧青山羊和魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響。但對單胎品種

6、沂蒙黑山羊的產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P＜0.05)，各基因型效應(yīng)值依次為CC(1.1715)＞AA(1.0897＞AC(1.0577)。C719T突變和A959C突變對濟寧青山羊、魯北白山羊、沂蒙黑山羊的產(chǎn)羔數(shù)均沒有顯著影響。G1189A突變對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響，對魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P＜0.05)，各基因型效應(yīng)大小依次為AG(2.6014)＞GG(2.4416)＞AA(2.1806)。GDF9基因G1189A突變對濟寧青山

7、羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響，各基因型效應(yīng)大小依次為AG＞GG＞AA，與魯北白山羊相一致。G1189A突變對沂蒙黑山羊產(chǎn)羔數(shù)有極顯著影響(P<0.01)，各基因型效應(yīng)值依次為AA(1.4574)＞AG(1.1136)＞GG(1.0781)。 4、山羊BMP15基因全長的克隆與序列分析 以發(fā)表的綿羊、牛的BMP15基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計9對引物，采用PCR技術(shù)從山羊基因組中直接擴增BMP15基因片斷，克隆測序后連接成完整的山羊BMP

8、15基因(GenBank：EU743938)。生物信息學(xué)分析表明，序列全長6648bp，由兩個外顯子組成，第一外顯子328bp，第二外顯子851bp，共編碼394個氨基酸，中間被5309bp的內(nèi)含子隔開，把山羊BMP15基因全長與牛進行BLAST比對，DNA的同源性分別達到90.72％，與綿羊和牛比對，編碼序列同源性均為98％。氨基酸序列同源性分別達到98％和97％。 5、應(yīng)用F-CSGE技術(shù)分析山羊BMP15外顯子SNPs

9、 根據(jù)山羊BMP15基因序列設(shè)計一對引物橫跨整個第一外顯子，設(shè)計兩對引物覆蓋第二外顯子，應(yīng)用熒光-構(gòu)象敏感凝膠電泳(fluorescence-basedconformationsensitivegelelectrophoresis,F-CSGE)技術(shù)和DNA測序技術(shù)，搜索外顯子的SNPs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在山羊BMP15編碼序列的第901bp處發(fā)生了A→G單堿基突變，該突變使得第301位氨基酸殘基(成熟蛋白質(zhì)第32位氨基酸)由絲氨酸變?yōu)檐瞻?/p>

10、酸，在編碼區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)其它突變。 6、應(yīng)用LDR技術(shù)分析山羊BMP15基因多態(tài)性及其對產(chǎn)羔數(shù)的影響 應(yīng)用LDR技術(shù)對濟寧青山羊(234只)、魯北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)進行BMP15基因突變位點的群體檢測，三個品種均檢測到BMP15基因突變的三種基因型，經(jīng)卡方檢驗，魯北白山羊和沂蒙黑山羊符合Hardy-Weinberg定律，而濟寧青山羊不符合Hardy-Weinberg定律。在濟寧青山羊和魯北白山羊中，G為優(yōu)

11、勢等位基因，而在沂蒙黑山羊中A為優(yōu)勢等位基因。 利用SAS軟件GLM過程對BMP15基因突變位點的的基因型效應(yīng)和產(chǎn)羔數(shù)進行了最小二乘分析，結(jié)果表明BMP15突變位點的基因型對濟寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)沒有顯著影響，但對魯北白山羊的產(chǎn)羔數(shù)有顯著的影響(P＜0.05)，各基因型效應(yīng)值依次為GG(2.5621)＞AG(2.5350)＞AA(2.2257)，證明BMP15基因A901G突變是影響魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，而且含有G等位基因的個體

12、產(chǎn)羔數(shù)較多，可以做為多胎分子標(biāo)記。對沂蒙黑山羊的產(chǎn)羔數(shù)也有顯著影響(P＜0.05)，同樣是含有G等位基因的個體產(chǎn)羔數(shù)多。 7、應(yīng)用LDR技術(shù)分析山羊FecB基因多態(tài)性及其對產(chǎn)羔數(shù)的影響 應(yīng)用LDR技術(shù)對濟寧青山羊(234只)、魯北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)進行FecB基因突變位點的群體檢測，發(fā)現(xiàn)濟寧青山羊和魯北白山羊存在FecB基因突變，在兩個品種均檢測到三種基因型，A等位基因(野生型)為優(yōu)勢等位基因，經(jīng)卡方

13、檢驗，濟寧青山羊符合Hardy-Weinberg定律，而魯北白山羊不符合Hardy-Weinberg定律。在單胎品種沂蒙黑山羊未檢測到FecB基因突變。 利用SAS軟件GLM過程對FecB基因型效應(yīng)和產(chǎn)羔數(shù)進行了最小二乘分析，結(jié)果表明FecB基因突變位點的基因型對濟寧青山羊和魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)均沒有顯著影響。對魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響雖然沒有達到顯著水平，但GG型(2.8656)和AG型(2.5370)的產(chǎn)羔數(shù)明顯高于AA型(2.4