1、MicroRNAs(miRNAs)是非編碼的小RNAs，在動物、植物和真菌的轉錄后基因調節(jié)中起重要的作用。目前，已知病毒也可產生miRNAs。為研究人乳頭瘤病毒是否也可編碼miRNAs，用生物信息學的方法預測HPV16基因組miRNA前體及其成熟的miRNAs。序列分析表明HPVl6可編碼一個pre-miRNAs。然后以pre-miRNAs推論出的成熟miRNA序列在3’UTR數(shù)據(jù)庫中尋找靶基因。候選miRNA前體可被切割成推定的3個成

2、熟的19-22堿基的miRNAs。通過在基因庫內進行序列類比，結果發(fā)現(xiàn)很多候選的細胞和病毒的靶基因(如HPVl6 L1)可不完全的結合這些病毒編碼的vmiRNA序列，因此有可能潛在抑制這些基因mRNA的翻譯?？寺PV16vmiRNA的表達質粒，轉染Hela細胞，實時定量PCR檢測細胞中MycBF-2的表達水平的差異，結果表明HPV16 vmiRNA的表達可使Hela細胞內的mRNA水平下降2-3倍。這些數(shù)據(jù)表明HPV16編碼的病毒mi

3、RNAs可能參與調節(jié)細胞和病毒自身的基因表達。本研究將為進一步實驗驗證HPV16 miRNAs的調節(jié)基因的作用奠定基礎。 小干涉RNA(small interfering RNA：siRNA)是一種序列特異性地轉錄后基因表達的調節(jié)因子，誘導序列特異的目標基因的沉默，強大而迅速地阻斷基因活性，可用于抑制癌蛋白表達的宮頸癌的基因治療。為了構建HPV16E6癌基因特異的U6質粒表達質粒，合成不同序列的siRNA，并進一步優(yōu)化其抑制HP

4、V病毒癌基因表達及其對子宮頸癌細胞生長繁殖的效應，選擇4個分別針對HPV16 E6 mRNA外顯子和內含子序列為靶序列，合成DNA鏈，構建表達HPV16 E6短發(fā)卡樣dsRNA的重組pSilencer1.0-U6載體，導入HPV-16 DNA陽性的宮頸癌細胞株CaSki中，觀察該細胞中HPV-16 E6、E7基因表達水平及其蛋白含量的變化，并觀察細胞生長被抑制的情況。結果發(fā)現(xiàn)四種HPV-16 E6 siRNA均能降低宮頸癌細胞CaSki

5、的生長速率。通過細胞生長曲線觀察到HPV16E6 shRNA表達質粒導入細胞0-96 h內，可降低細胞生長速度。熒光定量RT-PCR檢測HPVl6 E6 siRNA可使宮頸癌細胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因轉錄的mRNA水平降低，其中針對E6 mRNA內含子的重組shRNA只抑制E6基因的表達水平。Western blot分析表明4個HPV-16 E6 shRNA表達質粒轉染HPV16相關宮頸癌細胞作用72hrs后，未能檢

6、測到宮頸癌細胞中HPV-16 E6蛋白。由此可見，HPV16E6 siRNA能使宮頸癌細胞CaSki生長緩慢；選擇針對E6內含子的siRNA作用位點，特異性抑制E6表達；而針對E6外顯子的siRNA作用位點，可抑制E6和E7基因的表達，是用于治療HPV陽性宮頸癌細胞的理想靶位。骨形成是多種因子協(xié)同調節(jié)多種骨特異性基因表達的過程。骨發(fā)育相關基因的表達涉及復雜的信號分子網絡，其中轉錄因子Cbfal是一種關鍵的調節(jié)骨特異基因(如osteopo

7、ntin和osteocalcin)表達的因子，在骨發(fā)育中發(fā)揮不可替代的調控作用。喪失Cbfal的調節(jié)功能可引發(fā)骨質疏松癥(OSteoporosis)和骨硬化病(osteopetrosis)等代謝性骨病。成視網膜細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，pRb)被發(fā)現(xiàn)是cbfal誘導成骨細胞分化的共同活化因子，并且是介導骨發(fā)育所必需的。本研究組近期報道一種干擾素誘生蛋白p204與Cbfal的調節(jié)功能相關，作為Cbfal的共

8、同活化因子可增強骨的形成。 本研究進一步通過重組腺病毒Ad-p204As編碼反義p204 RNA抑制p204的表達后，多向分化潛能骨髓間充質干細胞系(pluripotent Mesenchymal stem cell line)C2C12喪失了Cbfal對成骨細胞特異性基因的誘導活化，揭示在骨形成中p204的誘導表達是Cbfal依賴性的基因活化表達所必需的。用多重蛋白免疫共沉淀和GST-pull-down實驗揭示，p204，Rb

9、和Cbfal可形成三蛋白的復合體，Rb作為一個連接子分別結合p204和Cbfal。而且通過染色質免疫沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation)在osteocalcin基因的啟動子上可檢測出該：p204/Rb/Cbfal轉錄復合物。缺失Rb結合位點的p204突變體失去了增強Cbfal依賴性的轉錄活性和骨形成；另外，通過報告基因和體外骨發(fā)生實驗表明，p204和Rb共同協(xié)同增強Cbfal依賴的基因活化和成骨細胞分化

10、，由此可見Rb是p204激活Cbfal活性的作用所必需的。上述結果表明在BMP-2信號作用下，Rb和p204在Cbfal介導的骨形成過程中起協(xié)同增強作用，p204/Rb/Cbfal通過Rb作為連接橋形成一個復合物，從而發(fā)揮增強骨發(fā)育的生物學功能。在骨發(fā)育中，轉錄因子Cbfal是由BMP-2誘導的一種關鍵的調節(jié)骨特異基因(如osteopontin和osteocalcin)表達的因子，在骨發(fā)育中發(fā)揮重要的調控作用。Ids蛋白也是一種BMP-

11、2誘導蛋白，且抑制BMP-2誘導的成骨細胞分化，為常見的抑制細胞分化的因子。為揭示其分子機制，本研究研究Ids能否與Cbfal相互作用并進一步抑制Cbfal的生物功能。用免疫共沉淀和GSI-pull-down實驗揭示，Id2和Cbfal可相互結合，Id2結合Cbfal的區(qū)域位于HLH區(qū)，Cbfal結合Id2的區(qū)域位于N端222-280的片段內。通過重組腺病毒．Ade-Id2轉導多向分化潛能骨髓間充質干細胞系(pluripotent Me

12、senchymal stem cell line)C2C12細胞，抑制了Cbfal對成骨細胞特異性基因的誘導活化，并降低了該細胞內ALP活性及細胞分泌的OCL數(shù)量，揭示在骨形成中，Ids抑制Cbfal的活性。而且通過chromatinimmunoprecipitation實驗在osteocalcin基因的啟動子上未能檢測出該Id2蛋白或Cbfal蛋白或兩者的復合物，揭示在骨形成中，Ids抑制Cbfal的DNA結合活性。通過熒光免疫染色技

13、術發(fā)現(xiàn)Id2蛋白在BMP-2誘導下，1H后在細胞內有表達蛋白存在，3H時由細胞核內向細胞核外轉移，6H時細胞核內的Id2蛋白含量減少，大部分轉移至細胞漿內。Western B10t實驗結果表明Id2蛋白可使BMP-2誘導的C2C12細胞中的p204和Cbfal水平下降。上述結果表明在BMP-2信號作用下，Idl，2，3在Cbfal介導的骨形成過程中起抑制作用，Id2可與Cbfal結合，從而抑制Cbfal結合到osteopontin基因的

14、啟動子上；另外，Id2降低骨發(fā)育特異的轉錄因子Cbfal和骨發(fā)育協(xié)同激活因子p204在骨發(fā)育早期的蛋白水平，從而抑制Cbfal介導的骨發(fā)育過程。Id2是否通過由細胞核到細胞漿的轉位，從而消除對Cbfal轉錄活性的抑制作用有待進一步研究證實。 綜上所述，本研究內容涉及miRNA與siRNA在宮頸癌腫瘤細胞中的基因調控作用和骨發(fā)育過程中p204，Rb，Cbfal，Ids四種蛋白之間的相互作用，研究結果如下： 1．HPVl6病

15、毒可編碼的病毒miRNA，該miRNA的編碼序列位于。HPV16基因組的L1基因3’UTR和LTR內，并參與調節(jié)細胞和病毒自身的基因表達。 2．針對HPVl6E6的siRNA能使宮頸癌細胞CaSki生長緩慢；選擇針對E6內含子的siRNA作用位點，特異性抑制E6表達；而針對E6外顯子的siRNA作用位點，可同時抑制E6和E7基因的表達，是用于治療HPV陽性宮頸癌細胞的理想靶位。 3．在BMP-2信號作用下，Rb和p204

16、在骨發(fā)育特異的轉錄因子Cbfal介導的成骨細胞形成過程中起協(xié)同增強作用，p204/Rb/Cbfal通過Rb作為連接橋形成一個復合物，結合在骨成熟標志基因OCL的啟動子DNA上。 4．在BMP-2信號作用下，Id1，2，3在骨發(fā)育特異的轉錄因子Cbfal介導的骨形成過程中起抑制作用，Id2可與Cbfal結合，從而抑制Cbfal結合到OCL基因的啟動子上；另外，Id2降低Cbfal和骨發(fā)育協(xié)同激活因子p204在骨發(fā)育早期的蛋白水平，