1、目的:SR-PSOX/CXCL16是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,與動脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān),但其功能尚不明確。構(gòu)建抑制人SR-PSOX基因表達的發(fā)夾式siRNA慢病毒表達載體,建立利用RNA干擾技術(shù)研究人SR-PSOX基因功能的平臺。
　　方法:在基因功能的研究領(lǐng)域,RNAi可特異、高效、快速地產(chǎn)生針對特定基因的沉默效應(yīng),被廣泛應(yīng)用于哺乳動物基因功能的研究。本研究通過Invitrogen公司專用軟件對人SR-PSOX基因編碼區(qū)分

2、析,設(shè)計并合成shRNA單鏈。通過T4連接酶將退火反應(yīng)合成的shRNA雙鏈克隆入含RNA PolⅢ聚合酶表達元件的pENTRTM/U6入門載體,通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建靶向人SR-PSOX基因的發(fā)夾式siRNA(shRNA)入門載體,測序正確后使用LR重組技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的shRNA慢病毒表達載體,PCR鑒定挑選得到正確重組子,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將shRNA慢病毒表達載體包裝入病毒宿主293FT細胞,72h后收集含假病毒顆粒的上清液,體外直接感染

3、表達人SR-PSOX基因的人肝癌細胞株(HepG2)。通過RT-PCR、間接免疫熒光法及Western印跡法檢測人SR-PSOX基因的表達水平。
　　結(jié)果:成功地構(gòu)建了靶向人SR-PSOX基因的發(fā)夾式siRNA慢病毒表達載體;shRNA慢病毒表達載體可使人SR-PSOX基因的mRNA和蛋白表達量顯著下降,抑制率達到80％,可在培養(yǎng)細胞中有效地沉默人SR-PSOX基因。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建出靶向人SR-PSOX基因的shRNA