1、研究背景和目的:
　　 創(chuàng)傷愈合是一個修復組織完整性的多相過程。包含了多種細胞，細胞外基質(zhì)，細胞因子和生長因子之間的機能協(xié)調(diào)及相互作用。異常的創(chuàng)傷愈合過程，如：燒傷，挫傷和外科手術(shù)導致的不規(guī)則的皮膚創(chuàng)傷愈合，會導致瘢痕疙瘩盼發(fā)生。瘢痕疙瘩不僅影響患者的軀體功能，常導致焦慮等心理問題。臨床治療治療后復發(fā)率高，對于整形外科醫(yī)生，是一個很大的挑戰(zhàn)。
　　 目前，關(guān)于瘢痕疙瘩的研究集中在細胞因子，生長因子和基因治療等方面。轉(zhuǎn)化生

2、長因子-β1(Transformating growth factor-betal，TGF-β1)是一種多功能的生長因子，與創(chuàng)面愈合和瘢痕形成密切相關(guān)。核因子κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和TGF-βreceptorⅡ(TβRⅡ)是TGF-β1信號的重要的細胞內(nèi)介質(zhì)。TGF-β1通過這些通路調(diào)節(jié)成纖維細胞的增殖

3、。阻斷TGF-β1的信號通路是一種有效防治瘢痕疙瘩的方法。
　　 噬菌體肽庫(Peptide library)技術(shù)是噬菌體展示技術(shù)的一個非常重要的分支。其原理是通過把大量的隨機肽段與絲狀噬菌體的外殼蛋白(PⅧ或PⅢ)融合表達、組裝，從而展示于噬菌體顆粒表面以組成每個噬菌體都帶有一個不同肽段的重組噬菌體庫，然后用目的蛋白來篩選與之相互作用的噬菌體肽。通過分析所篩選到的噬菌體肽的結(jié)構(gòu)和序列，為蛋白質(zhì)分子之間(如抗原與抗體、受體和配體

4、、酶與底物)的相互作用機理提供理論依據(jù)與實驗支持。噬菌體隨機肽庫日益受到人們的重視，噬菌體隨機肽庫技術(shù)也日趨成熟，并根據(jù)應用目的不同而構(gòu)建了各種不同的肽庫，其已成為探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、尋求高親合力生物活性的配體分子、探測未知蛋白空間結(jié)構(gòu)表位的工具，在蛋白分子相互識別的研究、新型疫苗的研制以及藥物的開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。已從噬菌體隨機肽庫中篩選獲得多種生長因子的特異性的配體和抗原表位，如CTGF，EGF，F(xiàn)GF和V

5、EGF等。
　　 本研究的目的是從噬菌體隨機12肽庫中篩選獲得TGF-β1噬菌體模擬肽。噬菌體上表達的特異性的模擬肽可能包含類似于TGF-β1的外源性多肽，可能是TGF-β1的受體阻斷劑，與TGF-β1競爭性結(jié)合其受體，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖。應用噬菌體隨機肽庫篩選獲得TGF-β1的肽抑制劑，有助于抑制TGF-β1的作用，可能為防治瘢痕疙瘩提供新的機遇。
　　 材料和方法:
　　 第一部分應用噬菌體隨機

6、十二肽庫篩選TGF-β1相關(guān)模擬肽的實驗研究
　　 以人TGF-β1單克隆抗體為靶，進行4輪生物淘選，富集包含特異性模擬肽的噬菌體。對洗脫物和擴增物進行滴度測定。宿主菌劃線接種、培養(yǎng)進行噬菌體擴增。接種宿主菌單菌落于培養(yǎng)基中，計數(shù)藍斑，計算噬菌體滴度。隨機挑選第4輪生物淘選的噬菌體藍斑，擴增后計算噬菌體產(chǎn)出/投入比，評估噬菌體的回收率。應用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測單克隆噬菌體的結(jié)合力，將噬菌體DNA沉淀、離心，進行瓊脂糖

7、凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。噬菌體DNA和-96gⅢ測序引物一起送北京華大基因有限公司，進行染料示蹤的雙脫氧法自動測序。應用核酸Blast系統(tǒng)檢測模擬肽DNA的相似性。
　　 第二部分 TGF-β1噬菌體模擬肽抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的實驗研究
　　 以人TGF-β1單克隆抗體包被孔板，加肽庫，共篩選4輪，富集包含特異性模擬肽的噬菌體。由北京華大基因有限公司進行染料示蹤的雙脫氧法自動測序。應用核酸相似性比較數(shù)據(jù)庫(Bl

8、ast系統(tǒng))檢測模擬肽DNA的相似性。共獲得4個噬菌體模擬肽，進行下一步的離體試驗。
　　 從經(jīng)過病理學鑒定的瘢痕疙瘩培養(yǎng)獲得瘢痕疙瘩成纖維細胞。應用組織塊培養(yǎng)法獲得瘢痕疙瘩成纖維細胞。
　　 噻唑藍(MTT)法檢測活細胞數(shù)量，檢測TGF-β1對細胞增殖的影響。共設13組：包括陰性對照組、噬菌體M13對照組、TGF-β1對照組各1組和噬菌體模擬肽組10組。
　　 應用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑

9、盒和流式細胞技術(shù)檢測細胞的凋亡。共設5組：陰性對照組和4組噬菌體模擬肽組。Annexin V-FITC陽性和PI陰性表示細胞處于凋亡早期階段，二者均為陽性表示細胞處于凋亡晚期階段，二者均陰性為未凋亡細胞。
　　 模擬肽的細胞親和力檢測：共設13組：包括陰性對照組、噬菌體M13對照組(1012 pfu/ml)、TGF-β1對照組(5 mg/L)各1組和噬菌體模擬肽組10組(1012pfu/ml)。按照免疫熒光檢測試劑盒的操作指導說

10、明進行操作。以人單克隆TGF-β1抗體(紅色)和M13外殼蛋白(綠色)為一抗。
　　 采用實時定量PCR法對瘢痕疙瘩成纖維細胞核因子κB(NF-κB)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達進行檢測。共設13組：包括陰性對照組、噬菌體M13對照組、TGF-μ1對照組各1組和噬菌體模擬肽組10組。應用RNAiso試劑提取表皮細胞的總RNA。應用PrimeScriptTM RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，應用SYBR Premix Ex

11、TaqTMⅡ進行PCR反應。反應條件為：30 s，95℃；95℃5s，58℃31 s(40個循環(huán))。引物序列為：(1)β-肌動蛋白：上游：5’TGACGTGGACATCCGCAAAG3’，下游：5’CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3’(204 bp)；(2)NF-κB：上游：5’CTGTAACTGCTGGACCCAAGG3’，下游：5’CTTTTTCCCGATCTCCCAGCT3’(209 bp)；(3)CTGF：上游：5’CC

12、TCTTCTGTGACTTCGGCTC3’，下游：5’GAACGTCCATGCTGCACAG3’(188 bp)。
　　 應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，應用單因素方差分析法(one-way ANOVA)和Dunnet's檢測方法分析各組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1，應用噬菌體隨機十二肽庫篩選TGF-β1相關(guān)模擬肽的實驗研究
　　 經(jīng)過

13、4輪生物淘選，獲得的噬菌體總量及其產(chǎn)率均逐漸升高，包含有特異性模擬肽的噬菌體獲得了富集，ELISA檢測獲得TGF-β1的標準品-吸光度值的曲線。結(jié)果顯示篩選獲得的噬菌體具有較好的結(jié)合活性，測序獲得10個與促進成纖維細胞增殖或抑制細胞增殖有關(guān)的堿基序列。經(jīng)過Blast系統(tǒng)檢測，其中1個模擬肽(No.1)與TGF-β1相似，3個模擬肽(No.2，5，8)與TGF-β2相似，5個模擬肽(No.3，6～8，10)與TβRⅡⅠ受體相似，3個模擬肽

14、(No.4，5，8)與TGF-β誘導因子相似，1個模擬肽(No.9)與NF-κB相似，6個模擬肽(No.4～9)與細胞分裂原素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)相似。
　　 2，轉(zhuǎn)化生長因子-β1噬菌體模擬肽抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的實驗研究
　　 在570 nm處檢測吸光度A值，MTT結(jié)果顯示陰性對照組的A值為0.22(保留小數(shù)點后兩位數(shù)字M13對照組也是0.2

15、2)，TGF-β1對照組不同濃度(0.05、0.5、5μg/L)的A值分別為0.29、0.31、0.35，單因素方差分析和Dunnet's方法分析結(jié)果顯示TGF-β1對照組與陰性對照組間差異有統(tǒng)計學意義。TGF-β1對照組能夠顯著地促進瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖(P<0.01)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示在陰性對照組和噬菌體M13對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在陰性對照組和第5、6組噬菌體模擬肽組之間，以及陰性對照組和低濃度(1010

16、pfu/ml)的第7、10組噬菌體模擬肽組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是陰性對照組和其他噬菌體模擬肽組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結(jié)果提示4種噬菌體模擬肽(第7～10組)能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖。
　　 對MTT結(jié)果中能夠抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的4種噬菌體模擬肽(第7～10組)，進一步評估其促使瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的作用。相對于陰性對照組，這4種噬菌體模擬肽(第7～10組)能夠輕度促使瘢痕疙瘩凋

17、亡，能夠誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的晚期階段。
　　 免疫熒光檢測結(jié)果顯示TGF-β1對照組和10種噬菌體模擬肽組能夠與瘢痕疙瘩成纖維細胞相結(jié)合，但是噬菌體M13對照組不能與瘢痕疙瘩成纖維細胞相
　　 結(jié)果:
　　 實時熒光定量PCR檢測TGF-β1對照組和各噬菌體模擬肽組(1～10組)NF-κB及CTGF的表達水平，與陰性對照組(表達量設為1)相比，TGF-β1對照組和第1～4噬菌體模擬肽組NF-κB和CTGF

18、的表達升高，第5～6噬菌體模擬肽組變化不明顯，而第7～10噬菌體模擬肽組表達減弱。其中NF-κB的表達量分別是陰性對照組的0.28、0.26、0.46、0.30倍，CTGF的表達量分別是陰性對照組的0.26、0.60、0.34、0.17倍。
　　 結(jié)論:
　　 1，從噬菌體隨機十二肽庫中可淘選到與TGF-β1相關(guān)的噬菌體模擬肽。
　　 2，4種噬菌體模擬肽能夠與瘢痕疙瘩成纖維細胞相結(jié)合，并輕度促使瘢痕疙瘩成纖維細