1、目的：本研究旨在構建抗人B7-H4單鏈抗體庫，并利用核糖體展示技術篩選出高特異和高親和性的鼠源抗人B7-H4單鏈抗體;以期抗B7-H4單鏈抗體能更好的應用于腫瘤的預防與免疫治療中。
　　方法：從培養(yǎng)的人A549細胞中獲得總RNA，利用RT-PCR技術擴增出B7-H4胞外區(qū)基因，通過雙酶切技術，將該基因插入原核表達載體pET-28a(+)中進行原核表達。
　　將得到的B7-H4胞外區(qū)蛋白純化，作為抗原用于免疫Balb/c小鼠，

2、每兩周免疫一次，共免疫4次，免疫結束后，從免疫小鼠的脾臟中提取總RNA，并設計簡并引物逆轉錄合成cDNA，利用PCR技術合成小鼠的VH-linker和Vκ-linker序列，通過SOE-PCR技術將二者連接得到產(chǎn)物VH/Vκ，將其插入pUM-19T載體并轉化至E.coli DH5α，并用菌落PCR技術進行鑒定和測序分析。
　　通過核糖體展示技術從已構建的抗B7-H4單鏈抗體庫中篩選出抗B7-H4單鏈抗體。將已構建成功的抗B7-H4

3、單鏈抗體庫經(jīng)體外轉錄翻譯，形成“單鏈抗體-核糖體-mRNA”三元復合物，繼而用于進行體外篩選。先用His蛋白負篩，再用B7-H4蛋白為抗原正篩，進行三輪篩選后，利用RT-PCR技術擴增目的單鏈抗體基因片段，插入原核表達載體pET-43.1a(+)，轉化至E.coli DH5α，并用菌落PCR技術鑒定和測序分析。將測序正確的陽性重組子轉化至Ecoli BL21(DE3)中，用IPTG進行誘導原核表達。
　　將經(jīng)鎳柱親和純化后的單鏈抗

4、體蛋白進行間接ELISA檢測，從而篩選出一株高效表達目的蛋白的具有高特異性親和力的單鏈抗體，并用Western blotting進一步檢測其特異性。
　　結果：克隆表達出了B7-H4胞外區(qū)蛋白，大小為27 kDa，構建的核糖體展示庫中重鏈為439 bp、輕鏈為680 bp，VH/Vκ為1098bp，篩選出的scFv蛋白大小約為110 kDa，與B7-H4具有高親和力和特異性。
　　結論：本研究獲得了人B7-H4胞外區(qū)重組蛋白