1、草地早熟禾(Poa Pratensis L.)是溫帶地區(qū)常用的優(yōu)質冷季型草坪草種，是已知的抗寒能力最強的草坪草種之一。植物體內存在多條低溫信號傳遞和調控途徑，其中,DREB1/CBF調控途徑被認為是植物抵御低溫的主要途徑。DREB1/CBF基因是植物響應低溫脅迫的轉錄激活因子，它通過調控下游基因包括冷應答基因(COR)的表達來提高植物的抗寒能力。
　　本研究從抗寒的草地早熟禾中克隆到一個DREB1/CBF類基因—PpCBF3，通過

2、轉化模式植物擬南芥，旨在快速研究該基因在抗寒性中的作用，為改良冷敏感多年生草坪草種的抗寒性奠定基礎。本實驗主要研究結果如下:
　　(1)從低溫處理后的草地早熟禾葉片中分離出一個開放閱讀框(ORF)全長為732bp，編碼243個氨基酸的基因。序列分析表明該基因在AP2 DNA結構域的上游和下游分別具有PKK/RPAGRXKFXETRHP和DSAEL這兩段DREB1/CBF轉錄因子的特征序列。根據系統(tǒng)進化樹分析，PpCBF3與多年生黑

3、麥草LpCBF3同源性最高，與其他單子葉植物和擬南芥的DREB1/CBF3基因也有很高的同源性，因此認為PpCBF是一個DREB1/CBF轉錄因子。
　　(2)瞬時轉化擬南芥原生質體實驗結果表明，PpCBF3特異地定位于細胞核中，與基因中具有核定位信號(NLS)的結果相符。
　　(3)熒光定量PCR實驗和半定量實驗表明，PpCBF3基因受低溫誘導，低溫處理15min時PpCBF3已響應表達，1h表達量最高，24 h后其表達量

4、仍顯著高于常溫狀態(tài)。在干旱脅迫和高鹽脅迫下，草地早熟禾PpCBF3基因的mRNA相對表達量并無明顯改變，因此推測PpCBF3不響應干旱脅迫(20％ PEG-6000)和鹽脅迫(150 mM NaCl)。
　　(4)通過農桿菌侵染法轉化擬南芥，通過雙丙胺膦(Basta)篩選和PCR鑒定，得到12個陽性轉基因株系。對其進行冷凍(-20℃)處理，并根據葉片枯黃率的結果篩選出5個穩(wěn)定的抗性轉基因株系，即line3，line6，line9，

5、line11和line12。mRNA相對定量表達分析和western印運分析表明，轉基因株系的PpCBF3都能夠在常溫下穩(wěn)定表達。
　　(5)在常溫下，轉基因擬南芥中DREB1/CBF下游基因COR15a，COR6.6/KIN2，COR47和COR78/RD29a和脯氨酸合成的關鍵酶基因P5CS的相對表達量都顯著高于WT植株。而在低溫處理后，盡管WT中這些基因的表達量提高，轉基因株系中這些基因的表達量仍然顯著高于WT。另外，在冰凍

6、處理后，轉基因擬南芥葉片相對電導率，F(xiàn)v/Fm值和葉綠素含量都顯著高于WT; DAB染色和NBT染色結果顯示，WT擬南芥在低溫脅迫下的H2O2和O2·-含量更高。
　　(6)轉基因擬南芥普遍出現(xiàn)開花推遲、矮化或生長延緩等特性，這些特性對多年生草坪草種的基因改良有著極大的意義。
　　綜上所述，從草地早熟禾中克隆到轉錄因子PpCBF3，它特異受低溫誘導，對干旱脅迫和鹽脅迫沒有響應。通過轉化模式植物擬南芥，初步確定該基因通過對下游