1、目的:
　　人巨細胞病毒(HCMV)是皰疹病毒科β屬病毒，種屬特異性強，人是其感染的唯一宿主。HCMV普遍存在于60-90％人群中，它不僅是免疫抑制患者的嚴重致病原，也是引起新生兒先天及圍生期感染最常見、危害最大的一種病原體。HCMV感染可引起患兒的肝脾腫大，新生兒病理性黃疸，顱內鈣化等多器官多系統(tǒng)的疾病和畸形，危害巨大。也可在AIDS和器官移植等免疫功能缺陷的患者中導致致死性的感染。研究HCMV感染的致病機制及防治對減少HCMV

2、致病危害有重大意義。HCMV的復制及感染依賴于宿主細胞對病毒基因的轉錄時相，轉錄形式等復雜影響，不同時相的病毒基因轉錄產物在病毒復制過程中發(fā)揮各自不同功能和作用。因此研究病毒基因的轉錄調控和基因調控元件，對進一步研究HCMV基因的相關生物學作用，揭示HCMV致病機理具有重大意義。UL142基因位于HCMV臨床分離株UL/b'區(qū)，在不同分離株中存在多種起始位置不同的基因轉錄本，這種轉錄起始位置的差異提示UL142基因不同轉錄本的表達調控存

3、在差異，本文采用Northern blot及5'rapid amplification of cDNAends（5'-Full Race）等方法，對UL142基因的結構進行精細研究;同時采用pGL3雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferase(@)Reporter Assay System)，凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)對UL142基因的轉錄調控機制進行了深入研究;應用酵母雙雜交技術(Yeast two-hybrid sys

4、tems)，篩選與UL142基因編碼蛋白(pUL142)相互作用的文庫蛋白，針對其中的Snapin(SNAP相關蛋白)，通過體外轉錄MagneGSTTM Pull-down技術，進一步確定pUL142與之相互作用，并應用激光共聚焦顯微鏡技術在細胞內進行蛋白質共定位。UL142作為重要的免疫調節(jié)基因，可抑制NK細胞激活，從而對抗NK細胞的清除作用，因此是研究病毒蛋白如何逃避宿主免疫作用一個重要切入點，為揭示HCMV的致病機理提供理論依據。

5、
　　方法:
　　一、實驗材料
　　采用中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保留的HCMV低傳代臨床分離株Han，人胚肺成纖維細胞(HELF)和人腎上皮細胞293細胞(Human Embryonic Kidney293 cells)購買于中科院的上海的細胞庫;Northern blot試劑盒購自Roche公司，5'-Full Race Kit購自TakaRa公司，pGL3Luciferase ReporterVector

6、s、Dual-Luciferase(@) Reporter Assay System，TheWizard(@) MagnePlasmid DNA Purification System，MagneGSTTM Pull-down試劑盒均購買于Promega公司;LightShift(@)Chemiluminescent EMSA Kit購自thermo公司;human fetal braincDNA library由中科院武漢病毒所肖庚富

7、教授惠贈;Yeasttwo-hybrid systems購自Clontech公司;引物合成及測序由Invitrogen完成;常用設備包含Beckman臺式低溫高速離心機、Bio-rad PCR循環(huán)儀、Bio-rad電穿孔和CO2培養(yǎng)箱等;所用數據庫和分析及應用軟件包含GeneBank、primer premier5.0軟件設計引物;應用DNAClub、BioEdit、DNAStar; Sequin軟件序列比對與提交;TRANSFAC軟件

8、預測。
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬┤司藜毎《綰L142基因轉錄及轉錄調控的研究
　　1、Northern blot
　　人工合成UL142基因Digoxin(DIG)標記特異性RNA探針，應用Northern blot方法檢測UL142基因轉錄本在不同感染時期的轉錄本的種類、長度及豐度。
　　2、5'RACE
　　通過5'RACE確定UL142轉錄本的5'末端。
　　3、熒光素酶報告基因檢測

9、實驗
　　(1)構建pGL3 Basic-UL142基因的上游非編碼區(qū)重組質粒，研究UL142基因的上游非編碼區(qū)1000bp是否存在轉錄調控活性;
　　(2)應用5'末端系列缺失突變方法，依次遞減300bp縮小調控區(qū)域范圍，確定含有轉錄調節(jié)活性片段;
　　(3)構建pGL3 Promoter-調控元件重組質粒，進行熒光素酶檢測，確定正負調控元件。
　　4、凝膠電泳遷移率實驗(electrophoretic mob

10、ility shift assay，EMSA)
　　(1)應用TRANSFAC軟件預測與HELF核蛋白相互作用的轉錄因子;
　　(2)合成含有標記生物素和未標記生物素的調控元件，heat shocktranscription factor1(HSF1)成品蛋白購自于Abcam公司，提取HCMV感染的HELF細胞的核蛋白;
　　(3)依據EMSA Kit說明操作，確定HSF1與正調控元件的特異性結合能力。
　　（二

11、）人巨細胞病毒UL142編碼蛋白相互作用蛋白篩選及功能研究
　　1、酵母雙雜交篩選
　　(1)以pACT2(含轉錄激活域，activition domain，AD)為酵母表達載體的人胎腦cDNA文庫增殖，提取文庫質粒;
　　(2)構建轉錄結合域(DNA binding domain，BD)重組質粒pGBKT7-UL142;
　　(3)將pGBKT7-UL142重組質粒轉化到酵母細胞AH109中，并將提取的文庫質粒

12、轉化到含有UL142基因的AH109酵母細胞中，通過二缺（-Leu-Trp SD）和四缺培養(yǎng)基（-Ade-His-Leu-Trp SD）篩選相互作用的克隆。在二缺培養(yǎng)基上觀察轉化效率，四缺培養(yǎng)基進行顯色反應。初步確定與UL142基因編碼蛋白(pUL142)與人胎腦文庫相互作用蛋白的陽性克隆;
　　(4)提取陽性克隆的酵母質粒，用電穿孔轉化方法將質粒轉化到大腸桿菌中，在氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中篩選出與pUL142相互作用的文

13、庫質粒。將相互作用的文庫質?；剞D到含有UL142基因的AH109酵母細胞中，在四缺固體培養(yǎng)基中確定相互作用的文庫蛋白;
　　(5) PCR鑒定后挑取陽性克隆進行測序，經Genbank生物信息學軟件進行BLAST分析。最終篩選出的文庫質粒為pACT2-Snapin。
　　2、GST Pull-down技術
　　(1)構建重組質粒pGEX-Snapin;
　　(2)在大腸桿菌BL21中表達GST-Snapin，并將其

14、固相化到MagneGSTTMParticles上。利用TNT體外轉錄翻譯系統(tǒng)，表達pGBKT7-UL142融合蛋白;
　　(3)將pGBKT7-UL142與所篩選出的文庫蛋白GST-Snapin共同孵育，通過洗脫結合得到相互作用的蛋白復合物，并應用進行Western blot技術鑒定。
　　3、激光共聚焦技術的細胞定位分析
　　(1、構建帶有熒光表達重組質粒pUL142-GFP和pDsRed-Snapin;
　　

15、(2)通過脂質體轉染法將pUL142-GFP和pDsRed-Snapin共轉染入293細胞中;
　　(3)應用共聚焦顯微鏡技術分別在488nm和543nm波長的激發(fā)光下，觀察互作蛋白在細胞內的共定位。
　　結果:
　　一、人巨細胞病毒UL142基因轉錄及轉錄調控的研究
　　1、通過Northern blot檢測，在Han株的感染晚期(Late，L) RNA中共檢測到三種UL142基因轉錄本。
　　2、5，R

16、ACE實驗結果表明，UL142基因轉錄本具有不同的5'末端。5'末端分別位于第9425，9904和9974位核苷酸(GenBank no.GQ981646)。
　　3、通過熒光素酶報告基因表達檢測實驗，確定了UL142基因轉錄本上游一個33bp的正調控元件。應用TRANSFAC軟件預測與正調控元件相互作用的轉錄因子HSF1。
　　4、EMSA結果表明，HELF核蛋白中含有與正調控序列的結合蛋白HSF1，此種結合可以被同源序列

17、競爭，通過super-shift及HSF1成品蛋白對照，說明結合蛋白與調控序列的結合為特異性結合。
　　二、人巨細胞病毒UL142編碼蛋白相互作用蛋白篩選及功能研究
　　1、通過酵母雙雜交技術，篩選出與pUL142相互作用的人胎cDNA文庫蛋白共17種，其中篩選的陽性克隆與Snapin高度同源，同源性99％。
　　2、通過GST Pull-down技術，在體外驗證pUL142與Snapin直接相互作用。
　　3、

18、利用激光共聚焦顯微鏡觀察到pUL142-GFP與pDsRed-Snapin共定位于293細胞質中。
　　結論:
　　1、HCMV UL142基因為L期基因;共有三種轉錄本結構，具有不同的5'末端;HCMV UL142基因上游非編碼區(qū)存在一個正調控元件，可與轉錄因子HSF1特異性結合;
　　2、篩選17種與HCMV UL142編碼蛋白相互作用的文庫蛋白，其中Snapin與HCMV UL142編碼蛋白具有直接相互作用，并共