1、[研究背景]:
　　有研究表明，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)參與了糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的病理過程，最終引起心肌功能的損害。目前認為，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)對DCM的形成和發(fā)展起著重要作用。血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，AC

2、E2)是RAS的新成員，主要分布于腎臟和心血管的內皮細胞。ACE2的主要功能是水解血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)生成Ang(1-7)進而對機體發(fā)揮保護作用。有研究顯示，循環(huán)系統(tǒng)中ACE2水平的升高使RAS偏于ACE2-Ang1-7-Mas軸發(fā)揮作用。在ACE2-Ang 1-7-Mas軸中ACE2通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路抑制

3、AngⅡ導致的心肌細胞肥厚和重塑。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2terminal protein Kinase，JNK)和p38MAPK信號轉導通路在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用。因此，我們在DCM動物模型的基礎上通過基因轉染使ACE2基因過表達，觀察ACE2對糖尿病心肌病心肌病理改變的影響及內質網應激的影響。
　　[研究目的]:
　　1.構建糖尿病心肌病動物模型。
　　2.明確內質網應激相關因子

4、表達情況。
　　3.檢測ACE2基因轉染后心肌ACE2蛋白表達。
　　4.觀察ACE2基因轉染對糖尿病心肌病大鼠內質網應激的影響，并探討其發(fā)揮作用的可能機制。
　　[研究方法]:
　　1.DCM大鼠模型的建立
　　雄性Wistar大鼠64只，體重約200-220g，隨機分為正常對照組（n=12只）和造模組（n=52只）。標準大鼠飼料喂養(yǎng)1周后，禁食12h，造模組大鼠給予鏈脲佐菌素(STZ)65mg/kg腹腔

5、內注射，正常對照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠成模的診斷標準為:連續(xù)2次空腹血糖＞16.7mmol/L。血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)3個月，最終獲得50只糖尿病心肌病大鼠。將糖尿病心肌病大鼠隨機分為三個組:ACE2組(n=16只)心肌注射100μl(1×109pfu)攜帶ACE2基因的重組腺病毒;EGFP組（n=17只）心肌注射等量的空載重組腺病毒即增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent pr

6、otein，EGFP);DCM組(n=17只)心肌注射等量的無菌生理鹽水。STZ注射前和注射后一周，測量各組大鼠空腹血糖。其中DCM組死亡1只，最終獲得ACE2組(n=16只)，EGFP組（n=17只）及DCM組（n=16只）。基因轉染后15天從ACE2組和EGFP組及DCM組每組取6只大鼠處死，應用Western blot檢測ACE2蛋白表達情況。應用彩色多普勒超聲心動圖儀對各組大鼠的心臟功能進行檢查，檢測的指標包括:左室舒張末期內徑

7、(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)，射血分數(shù)(ejection fraction，EF)，左心室縮短分數(shù).(fractional shortening，F(xiàn)S)。ELISA檢測心肌AngⅡ含量。
　　2.TUNEL染色檢測細胞凋亡
　　石蠟切片，經TUNEL染色

8、后，檢測心肌細胞的凋亡情況。
　　3.免疫熒光化學檢測
　　取石蠟切片，進行GRP78（santa Cruz公司，美國）和caspase12(santa Cruz公司，美國)免疫熒光化學檢測。
　　4.免疫組織化學染色
　　石蠟切片，進行IL-1β（美國Santa Cruz公司）和VCAM-1（英國abcam公司）免疫組織化學染色。
　　5.免疫印跡法(Western blot)
　　取左心室組織，提

9、取膜蛋白應用免疫印跡法檢測ACE2基因轉染后ACE2蛋白表達情況。提取總蛋白檢測CHOP、P-JNK、T-JNK蛋白的表達。
　　[研究結果]:
　　1.實驗進展情況
　　實驗過程中，正常對照組大鼠狀態(tài)良好，無死亡。糖尿病心肌病組大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿和體重減輕及易激惹現(xiàn)象。實驗過程中2只未達到DCM標準，1只大鼠死亡，總共61只大鼠完成實驗，正常對照組12只，ACE2組16只，EGFP組17只，DCM組16只。

10、r>　　2.TUNEL染色檢測細胞凋亡
　　行TUNEL染色，正常組心肌細胞少見凋亡細胞。ACE2組可見凋亡心肌細胞，但比DCM組和EGFP組顯著減少(P＜0.01)。DCM組和EGFP組與正常組相比心肌細胞凋亡數(shù)量明顯增多(P＜0.01)。
　　3.免疫熒光化學檢測
　　應用免疫熒光化學技術檢測大鼠心肌組織中GRP78和caspase12蛋白的表達水平。ACE2組心肌組織可見少量、分布稀疏的GRP78和caspase

11、12蛋白。DCM和EGPF組心肌細胞胞漿內可見分布濃密的GRP78和caspase12蛋白。ACE2組與DCM組和EGFP組相比GRP78表達明顯減少(P＜0.01);caspase-12在ACE2組的表達與DCM組和EGFP組相比也顯著降低(P＜0.01)。
　　4.免疫組織化學染色
　　應用免疫組織化學技術檢測大鼠心肌組織中IL-1β和VCAM-1蛋白的表達水平。ACE2組心肌組織可見稀疏分布的IL-1β和VCAM-1蛋

12、白。DCM和EGPF組心肌細胞胞漿內可見濃密分布的IL-1和VCAM-1蛋白。與DCM組和EGFP組相比，ACE2組IL-1β的表達明顯減少(P＜0.01);VCAM-1在ACE2組的表達與DCM組和EGFP組相比也顯著降低(P＜0.01)。
　　5.免疫印跡法(Western blot)
　　ACE2蛋白表達:ACE2組ACE2蛋白的表達明顯高于DCM組和EGFP組(P＜0.01);DCM組與EGFP組ACE2蛋白表達差異

13、無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　CHOP、P-JNK蛋白的表達:ACE2組CHOP、P-JNK蛋白的表達明顯低于DCM組和EGFP組(P＜0.01);DCM組與EGFP組CHOP、P-JNK蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6.心肌AngⅡ檢測
　　應用ELISA試劑盒檢測大鼠心肌組織中AngⅡ含量。心肌AngⅡ含量在ACE2組較DCM組和EGFP組明顯減少(P＜0.05);DCM組和EGFP組心肌A

14、ngⅡ含量與正常組相比明顯升高(P＜0.01)。
　　7.心功能檢測指標
　　檢測的心功能指標包括:左室舒張末期內徑(LVEDD)左室收縮末期內徑(LVESD)，射血分數(shù)(EF)，左心室縮短分數(shù)(FS)。實驗末，與DCM組和EGFP組相比ACE2組心功能各項指標均有好轉(P＜0.05)。
　　8.大鼠血糖測定
　　注射STZ之前，各組大鼠間血糖無明顯差異(P＞0.05)。注射STZ7天后，各組大鼠間空腹血糖，EG

15、FP組和DCM組及ACE2組較正常組明顯升高(P＜0.01)。
　　[研究結論]:
　　1.通過腹腔注射STZ并喂養(yǎng)3個月，成功建立了DCM大鼠模型，為本實驗的進行奠定了堅實的基礎。
　　2.GRP78作為內質網應激的標記分子，在DCM大鼠心肌組織中表達增多，說明內質網應激在DCM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　3.行TUNEL染色顯示DCM大鼠心肌組織中凋亡細胞明顯增多，提示心肌細胞凋亡參與了DCM的進展。