1、目的：優(yōu)化靈芝中性三萜組分的提取純化工藝，建立靈芝中性三萜組分的質(zhì)量控制方法，通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)靈芝中性三萜組分的抗腫瘤活性，并對(duì)其安全性進(jìn)行初步研究，為靈芝三萜抗腫瘤新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化靈芝總?cè)频奶崛」に?。⑵?yīng)用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，對(duì)靈芝中性三萜組分進(jìn)行富集純化。⑶采用紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-vis）建立靈芝中性三萜組分中總?cè)频暮繙y(cè)定方法。⑷運(yùn)用反相高效液相色譜（RP-H

2、PLC）技術(shù)，初步建立靈芝中性三萜組分的HPLC指紋圖譜。⑸采用MTT法體外檢測(cè)兩種不同方法（溶劑法和樹(shù)脂法）制備的靈芝中性三萜組分對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562、人髓系-白血病細(xì)胞株HL60生長(zhǎng)的抑制作用。⑹采用溶劑--熔融法，建立靈芝中性三萜固體分散體的制備方法。⑺分別建立小鼠H22和S180實(shí)體瘤以及腹水瘤的模型，觀察靈芝中性三萜組分對(duì)這兩種瘤株的抑瘤率（實(shí)體瘤）和生命延長(zhǎng)率（腹水瘤）的影響，評(píng)價(jià)靈芝中性三萜組分體內(nèi)抗腫瘤活性

3、。⑼分別通過(guò)曠野法、金屬棒法和傾斜板法，觀察靈芝中性三萜固體分散體對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)及機(jī)能協(xié)調(diào)功能的影響；根據(jù)入睡率和睡眠時(shí)間來(lái)判斷靈芝中性三萜固體分散體與戊巴比妥鈉聯(lián)用對(duì)小鼠的睡眠等神經(jīng)系統(tǒng)方面的影響；使用生理機(jī)能記錄儀記錄給藥前后靈芝中性三萜固體分散體對(duì)麻醉大鼠的呼吸頻率、血壓、心率等呼吸、心血管系統(tǒng)方面的影響。
　　結(jié)果：①通過(guò)正交試驗(yàn)篩選及考慮生產(chǎn)成本等因素，選定回流提取法最優(yōu)條件為：6倍量95％乙醇提取3次，每次1.5 h。

4、②使用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)靈芝中性三萜組分進(jìn)行富集純化，以1 BV/h的流速上樣，樹(shù)脂徑高比為1：10，按照上樣液體積與樹(shù)脂體積比為4:1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附（上樣液1 ml相當(dāng)于原生藥0.35 g），水洗至無(wú)色后，依次用4倍樹(shù)脂柱體積的飽和 NaHCO3水溶液、水、60%和95%乙醇洗脫，洗脫流速為2 BV/h，收集95%乙醇洗脫液，濃縮真空干燥即得。③采用UV-vis，建立了靈芝中性三萜組分中總?cè)频暮繙y(cè)定方法。④靈芝中性三萜組分的指

5、紋圖譜中可標(biāo)定11個(gè)特征明顯的共有峰，指紋圖譜分離效果理想。⑤兩種不同方法制備的靈芝中性三萜對(duì) K562和 HL60細(xì)胞的增殖均有抑制作用，樹(shù)脂法和溶劑法靈芝中性三萜作用于K562細(xì)胞48 h的IC50值分別是120.36μg/ml和149.36μg/ml，作用于HL60細(xì)胞48 h的IC50值分別是30.63μg/ml和24.49μg/ml。⑥采用溶劑-熔融法，以F68和44/14為載體（1:1），按藥物與載體的比例為1:8制備靈芝中

6、性三萜組分的固體分散體，從而改善三萜組分的水溶性。⑦靈芝中性三萜固體分散體的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有顯著抑制H22和S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用（P<0.05），500 mg/kg組的抑瘤率分別為55.73%和53.58%；溶劑法制備的靈芝中性三萜固體分散體亦能顯著抑制 H22、S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)（P<0.05），但其500 mg/kg劑量的抑瘤率分別為21.22%和31.61%；非制備成固體分散體的靈芝中性三萜CMC-Na混懸液對(duì)H22、S180

7、實(shí)體瘤的生長(zhǎng)也有顯著的抑制作用（P<0.01），其500 mg/kg劑量的抑瘤率分別為28.28%和23.31%；靈芝中性三萜固體分散體的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均能延長(zhǎng)H22、S180腹水瘤小鼠的存活時(shí)間，且以中、高劑量組的生命延長(zhǎng)率較為顯著（P<0.05），500mg/kg組的生命延長(zhǎng)率分別為35.4%和43.4%；溶劑法靈芝中性三萜固體分散體亦能顯著延長(zhǎng) H22、S180腹水瘤小鼠的生存時(shí)間（P<0.05），500 mg/kg組的生命延長(zhǎng)率分別

8、為27.1%和32.8%；中性三萜CMC-Na混懸組能延長(zhǎng)H22腹水瘤小鼠的生存時(shí)間，但對(duì)S180腹水瘤小鼠的生存時(shí)間的延長(zhǎng)作用更為顯著（P<0.05），500mg/kg組的生命延長(zhǎng)率分別為15.1%和20.5%。⑧靈芝中性三萜固體分散體（250~1000 mg/kg）對(duì)小鼠的自主活動(dòng)、機(jī)能協(xié)調(diào)功能、戊巴比妥鈉閾下催眠劑量及戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間均沒(méi)有明顯的影響；對(duì)麻醉大鼠的呼吸和心血管系統(tǒng)無(wú)影響（125~500 mg/kg）。
　　

9、結(jié)論：⑴經(jīng)優(yōu)化的提取方法，穩(wěn)定可行，可用于靈芝總?cè)频奶崛?。⑵AB-8型大孔樹(shù)脂吸附洗脫法具有選擇吸附性強(qiáng)，富集效果理想，解吸條件較溫和等優(yōu)點(diǎn)，可用于靈芝中性三萜組分的富集純化。⑶采用紫外-可見(jiàn)分光光度法建立的靈芝中性三萜組分的含量測(cè)定方法，該方法經(jīng)典穩(wěn)定，可作為靈芝中性三萜組分質(zhì)量控制中的定量控制方法。⑷采用RP-HPLC法建立的靈芝中性三萜組分的指紋圖譜，該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于靈芝中性三萜組分的定性質(zhì)量控制。⑸兩種靈芝中

10、性三萜對(duì) K562和 HL60細(xì)胞均有抑制增殖作用，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，且這兩種不同方法制備的靈芝中性三萜在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用差別不大。⑹以F68和44/14為載體，采用溶劑-熔融法制備固體分散體，能提高靈芝三萜的分散性，改善靈芝三萜的水溶性，有望提高靈芝中性三萜組分的生物利用度。⑺靈芝中性三萜固體分散體對(duì)H22和S180這兩種小鼠的瘤細(xì)胞不論是實(shí)體瘤還是腹水瘤，都有較強(qiáng)的活性；將靈芝中性三萜組分制備成固體分散體后抗腫瘤活性增加